咸丰六年（1856年）9月2日，太平天国爆发了著名的天京事变，这是一场由内讧而引发的血腥变乱，总计超过2万人在变乱中被残忍杀害。
东王杨秀清及其家眷、护卫三千余人，翼王石达开家眷及护卫一千余人在乱阵中被杀。北王韦昌辉、燕王秦日纲被天王洪秀全处死。太平天国高层领导几乎一扫而空，中下级军官死伤惨重。
杨秀清部属五千余人被洪秀全以鞭笞韦昌辉为名，诱入天王府中，缴械之后集中于几座库房内尽数杀害。这些人大都是从广西加入太平军的老兄弟，久经沙场，劳苦功高，杀掉他们无异于自毁长城。
太平天国经过天京事变后元气大伤，人才凋敝。更糟糕的是信仰的崩溃。无所不能的“天父”怎么会让这种自相残杀的事情发生。百姓们私下纷纷传言“天父杀天兄，总归一场空。打包回家转，还是做长工。”
洪秀全
为了挽救信仰危机，洪秀全采取了一系列的善后措施。先为杨秀清平反昭雪，将东王遇害说成是赎罪期已至而升天，又将杨秀清被害当天（7月7日）定为东王升天节。还将自己的第五子洪天佑过继给杨秀清，封为幼东王。
天京事变发生时，太平军原本形势一片大好。武昌被攻占，江西占据九江等八府五十余县，安徽占据有安庆、庐州等府县，天京附近的江南大营和江北大营也被击破。太平天国如果不发生变乱，一鼓作气攻占江西省城南昌，或者趁江南大营溃败之机一举攻占苏州、常州，控制江南财赋之地，局势将大有不同。可惜，一场内讧将这一切化为泡影。
太平天国运动形势坐标示意图
咸丰七年（1857年）10月，石达开率部自安庆出走，洪秀全不得已将安王、福王罢免，并派人携“义王金牌”请石达开回京，均遭拒绝。无奈，洪秀全只能从矮子里面拔高个，将亲信蒙得恩提拔为“正掌率”，又提拔陈玉成、李秀成两位年轻将领加入领导层。
这才终于稳定住局势，但军事重镇武昌却于1856年12月19日宣告失守，紧接着咸丰八年（1858年）5月，九江失守，守将林启容与一万七千余守城将士壮烈牺牲。幸亏陈玉成、李秀成在9月攻破重建后的江北大营，11月又在安徽取得三河大捷，歼灭湘军精锐七千余人，悍将李续宾兵败自杀。
这两场大捷大大延缓了湘军攻势，加上长江中游还有军事重镇安庆做为屏障，使太平军得以合军一处，于咸丰十年（1860年）5月6日，再次击破江南大营，取得了回光返照的空前大捷。
李秀成
不过总体来看，自天京事变后，太平军在湖北、江西、安徽等地均节节败退，唯有李秀成率军开辟的江浙战场形势喜人，但此举却无关大局。咸丰十一年（1861年）9月5日，军事重镇安庆的失陷，敲响了太平天国的丧钟，天京失陷只是时间早晚的问题。
天京事变虽然使太平天国元气大伤，但俗话说得好，“百足之虫，死而不僵”，天京事变只是太平天国领导层之间的互相倾轧，对驻守各地的太平军将士并无太大影响。加上又起用了陈玉成、李秀成这两员虎将，苦苦撑持8年之后，于同治三年（1864年）7月19日宣告覆灭。