随着疫情的常态化，检验人作为疫情防控的主力军之一，对于新冠核酸检测也越来越熟悉。在日常检测工作中，我们面临着标本数量多、风险高、长时间全身密闭的状态，同时也要保证检测结果的时效性和准确性。在核酸检测的任何环节，我们都要保持认真、专业、警惕，避免出错。
以下结合本实验室的经验，总结了核酸检测易错点，供大家参考~
首先，实验室严格划分了 4 个不同的工作区，分别是试剂准备区、标本制备区、基因扩增区及分析区。每个区配有缓冲间，均采用气压调节，使试剂和样品在整个核酸扩增实验过程中不受气溶胶污染，并减少扩增产物对人及环境的污染。
各区互相独立，操作器材专用，各区内的器材不可移至其它区混用，并设有传递窗确保试剂及样品在转移过程中不受污染。工作过程要确保实验室人、物及空气单向流动。在工作过程中严禁串区，如穿戴防护服在二区工作后，又进入一区或三区取物品等。
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我们按分区聊下各区的易出错点：
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试剂准备区
配制试剂是 PCR 实验中最重要的一个步骤，假如这一步出现失误，那么将会影响整个实验的结果。
我们实验室曾发生过因试剂配制时未充分混匀而导致大批实验结果出现异常的情况：使用新配制的试剂，每一板结果均出现大量标本内标未起、翘尾及曲线异常。
为了避免存在阳性对照及质控污染，点样人员迅速喷洒核酸去除剂，并更换至备用生物安全柜中进行操作，结果还是一片混乱。最后重新更换一批新配制的试剂后，危机才得以解除。
因此，在实验室进行核酸检测过程中，试剂配制显得尤为重要，是整个实验能够顺利进行的首要环节。配制试剂时应注意：
◆1 配制试剂前，需提前准备试剂，查看试剂批号，切忌新旧批号试剂混用以及新旧批号的阴阳性对照混用。将试剂拿出来溶解时，需要在室温下平衡一段时间后使用。
◆2 制备反应混合液时，将反应液和酶混合后，在振荡器上充分混匀，再进行分装。使用排枪加样槽配制试剂时，千万不要直接将反应液和酶倒入加样槽后，用吸头吹打混匀，这样操作会导致混匀不充分，尤其在配制大量试剂时，更易出现问题！正确做法是先将制成的混合液在振荡器上充分混匀后，再倒入加样槽中。
◆3 正确使用排枪，确保分装的每一孔试剂充足，尽量避免出现某孔试剂少、孔里存在气泡等情况，干扰后续实验。
◆4 操作过程中吸头、反应管等实验耗材均为一次性使用，严禁与 PCR 产物分析室的吸头混用，吸头切忌长时间暴露于空气中，避免空气中气溶胶污染。如试剂配制过程中进入其他区，回来再次操作时需要重新更换手套，以免造成试剂污染。
◆5 试剂准备区仅用于贮存试剂和标本制备的消耗品等材料，试剂盒中的阳性对照品及质控品不应当保存在该区，应当保存在标本制备区。
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标本制备区
标本制备区主要用于核酸提取，并将提取好的核酸加入扩增反应管中。有的实验室也会在该区进行核酸标本接收，包括拆带、消毒、排样以及核酸标本录入信息系统。在该区的注意事项如下：
◆1 标本应在振荡器上混匀后再进行加样，吸加标本的操作应严格按规范要求进行，遵守「慢吸快打」原则，尽量一次性完成，切忌反复多次抽吸，以避免液体飞溅至相邻提取孔中产生气溶胶造成标本间交叉污染。
◆2 加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管，避免样本间的交叉污染。加质控及阳性对照时，需瞬时离心，确保管壁和管盖上无液体残留，同时撕掉外层保护膜，并双手开盖，以防有液体溅出产生污染。
◆3 由于新冠病毒为 RNA 病毒，在核酸提取过程中，应注意提取完的核酸尽快点样并上机扩增，以免时间过长 RNA 出现降解，导致出现假阴性结果。
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基因扩增区及产物分析区
◆1 为避免气溶胶所致的污染，该区所有物品均不能与其他区域混用，并适当减少在该区的走动，以免通过本区物品及工作服将扩增产物带出。
◆2 PCR 产物拷贝量大（一般为 10^13 拷贝 /mL），极微量的 PCR 产物污染，就可形成假阳性，因此在本区要格外注意因 PCR 反应管意外开盖而造成大量拷贝后的产物泄露，引发严重的实验室污染事故。上机前需要确保反应管盖子盖合严密，扩增完后反应管不得在此区域打开。
◆3 扩增完成后及时将反应管取出，用一次性手套将产物反应管包裹丢弃。该区废物无需进行高压，因产物不存在传染性。强行进行高压，可能将反应管盖及核酸片段崩裂泄露，造成严重的气溶胶污染。
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反应曲线问题汇总
01
整板标本无反应曲线
这种情况比较少见，出现整板结果均异常时，第一时间考虑试剂配制的问题，反应管中无试剂、试剂过少、试剂过多均可能出现此类现象。取出扩增后的反应管，查看反应管中液体量是否正确。
下图为实验时配制试剂过多（液体充满了整个反应管）跑出的反应曲线，这个问题提醒我们，加完提取的核酸后，一一查看反应管的液体量也非常重要。
图 1
02
翘尾
标本经 PCR 扩增后，反应曲线表现为翘尾（扩增曲线非典型 S 型且 CT 值较高，如下图 2），表明目的基因浓度较低或存在实验室污染。不论是单一通道阳性，还是双通道阳性，均需按照要求对标本进行复核，复核时需要充分混匀及重新提取标本。使用两种扩增试剂对提取的核酸进行检测，每份标本均做双孔扩增。
如双孔双试剂复核均为阴性则报阴性，如复查后还是同一通道翘尾，但水空白及阴性对照正常，排除实验室污染后，需要立即向领导汇报复检情况，同时迅速查阅及掌握病人信息，按照流程进行上报及标本送检至疾控中心复核。
图 2
图 3
03
内标不出
单个标本内标不出时，将标本取出，首先查看管内有无拭子，若无，则直接通知临床重新采集标本。管内存在拭子，则充分混匀后重新提取核酸，并上机扩增，扩增结果仍为无内标，通知临床重新采样复查。
图 4
PS：其他内标不出的原因分析可点击查看往期文章：新冠核酸检测内标无扩增的 8 大原因分析！
04
曲线异常
出现下图中曲线异常情况，一是考虑该反应孔位可能存在气泡干扰，气泡中间容易形成折射，干扰仪器对荧光的采集。二是上层样本及下层试剂没有完全混匀，也可能会形成折射，导致荧光信号增强，这种现象随着加热及循环数增多、气泡破裂、样本和试剂混匀，荧光信号会逐渐趋于稳定。
图 5
PS：具体的异常扩增曲线及处理方案可查看往期推文：新冠核酸检测异常扩增曲线如何处理？！这 5 种诡异曲线需警惕
关于核酸检测你还有哪些问题，留言区见！
题图来源：图虫创意
文章插图来源：作者拍摄
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