来源：《西域研究》2022年第1期
内容提要
运用古蛋白质和古DNA分析，我们对阿勒泰青河县隋唐时期依希根M6石圹墓出土的一匹殉马进行了分子考古综合研究。古蛋白质组学结果明确其为家马，产生的318种肽链均与家马的骨骼形成、发育有关。古DNA结果揭示该殉马极有可能为蒙古马：1）父系Y染色体世系为rAX突变下的一个非欧亚大陆西部常见支系的新分支；2）母系线粒体世系为F1；3）生理特征相关基因推断其为栗色、耐力型、四步态、小型马（与跖骨全长推算马肩高的结果相一致）。蒙古马出现在阿勒泰地区的隋唐墓地中，可能反映了当地人群对不同品系的马匹资源的控制，选育蒙古马是一种适应山区环境的选择。
一
引言
隋唐时期，丝绸之路上频繁的东西方物种交流给中国的养马业带来了极大的发展，这一时期家马的品种数量在中国历史上也达到了顶峰。[2]新疆（西域）既是古代中国人西出的门户，也是横贯亚洲大陆的交通要道。2020年4月，新疆文物考古研究所配合阿勒泰地区青河县塔克什肯镇依希根新村建设，对用地范围内的墓葬进行了发掘。所发掘的9座墓葬均被盗扰。墓葬种类多样，地表多为碎石堆积的圆丘状封堆。有的石堆外有石圈，如M1、M3、M7、M8；有的石圈内有十字方向的石道，如M1；有的石堆内有石圈，如M5；有的石堆内有石围，如M6。根据发掘情况来看，九座墓葬的年代主要集中在春秋时期和隋唐时期。如M1是春秋时期或者更早的具有克列克苏尔（Khirgisuur）特点的墓葬。而M6则是典型的隋唐墓葬，出土了瑞兽葡萄镜以及纺织品等。依希根M6的地表有圆台状石块堆积的封堆，地下为竖穴土坑墓穴，墓口东西向，死者仰身直肢葬于墓底北侧，南侧殉葬一匹马。这匹马是此次发掘依希根墓地中发现的唯一一匹殉马。从哈巴河县的喀拉苏墓地到本次发掘的依希根墓地，隋唐墓葬在阿勒泰山南麓一直都有发现。这些墓葬的共同特点是，人在墓室北侧，头东足西，南侧多有殉马，马头向西，随葬有铁器。
本研究是对阿勒泰地区青河县隋唐时期的依希根M6出土马骨展开分子考古综合研究，具体涉及种属鉴定的古蛋白质检测，以及遗传谱系（父系Y染色体和母系线粒体）和生理特征推断等的古DNA检测，进而讨论隋唐时期阿勒泰地区出土马的生物学情况及其潜在的考古学意义。
二
材料与方法
（一）样本采集
依希根M6出土殉马一具（图一，左图）。我们从右跖骨上切割了一小块骨片（图一，右图）用于古DNA和古蛋白研究，同时鉴定了马匹的性别和年龄信息。根据保存犬齿及骨骼骨骺愈合情况判断性别可能为雄性，年龄5岁左右。
图一 依希根墓地出土的马骨
(左图，依希根M6墓地出土马骨；右图，本次检测所用材料)
（二）古蛋白检测
1.古蛋白提取
古蛋白提取工作在复旦大学科技考古研究院古蛋白质组学实验室进行，遵循标准流程，即称重、酸处理脱钙、明胶化、酶解、离心脱盐及抽干。[3]蛋白测序采用LC-MS/MS分析，通过60min梯度洗脱以0.200ul/min的流速分离肽，使用nLC 1200高效液相色谱系统，该系统直接与带有FAIMS ProTM设备的Orbitrap Exploris 480质谱仪（Thermo Fisher Scientific）连接。流动相A由0.1%甲酸组成，流动相B由80%乙腈和0.1%甲酸组成。数据采集方式设置为一次MS扫描，分辨率为60000（m/z 350-1600），然后使用HCD进行MS/MS扫描（周期为3s；归一化碰撞能30；隔震宽度为1.6m/z；分辨率为7500；最大注射时间30ms）。采用了-45CV和-65CV两个FAIMS实验，每个实验以1s/CV的最高速度获取数据。动态排除30秒的应用前体质量公差为10ppm，最终获取肽段序列。
2.古蛋白分析
使用PEAKS X软件（https://www.bioinfor.com/peaks-studio/）将原始数据与对应的蛋白库和常见污染库进行了比对。数据库从UniProt中生成。PEAKS搜索包括Peptide de nova、PEAKSDB和SPIDER。搜索设置了胰蛋白酶，允许最多2个酶切位点，每个肽最多6个修饰，即氧化（oxidation）、羟基化（hydroxylation）和脱酰胺化（deamidation），肽段和碎片离子的质量容忍误差设为10ppm和0.02Da，错误发生率（false discovery rate，FDR）为1%。首先，与马科的所有蛋白序列进行了比对，确定原始数据和对比数据库中保存最多的是I型胶原蛋白数据，因此，对I型胶原蛋白（collagen type I，COL1）的COL1A1（alpha 1）和COL1A2（alpha 2）数据库进行了合并、搜索和比对。[4]选取了普氏野马、驴、南美貘、白犀、黑犀、爪洼犀和羊驼的I型胶原蛋白数据集，分类标本参照Wilson等，[5]采用MEGA-X对I型胶原蛋白的数据集进行对齐，再使用PAUP 4进行系统发育分析。
（三）古DNA检测
1.文库构建与测序
DNA提取工作在复旦大学科技考古研究院古基因组学实验室进行，遵循标准流程，[6]最大程度地防止了实验操作带来的污染。我们采用了最新的DNA短片段提取方案。[7]为了更加符合高度降解DNA的特性，我们设计了更为敏感的短扩增子引物系统：其中线粒体扩增子为113-126 bp，SNP和STR均小于105 bp（表一）。具体包括三个高通量检测Panel：1）Panel 1（母系线粒体DNA和性别鉴定），基于该Panel，我们同时测试马DNA的控制区（15469-16083；615 bp）和细胞色素b（14215-14549；335 bp），实现了样本母系遗传谱系的确定，以及2个性别基因（SRY和AMEL）的测试，鉴定性别。2）Panel2（父系Y染色体DNA），对于鉴别为雄性的样本，该panel主要检测40个区分欧亚大陆不同马的品系的Y染色体SNP和6个STR情况，可以实现样本父系遗传谱系的确定。3）Panel 3（马的生理和体质特征），主要检测5个方面的相关基因，即毛色、运动能力、步态、身体大小/马肩隆高度和高原适应。
表一 高通量测序Panel的基本信息
多重PCR扩增靶向捕获实验的流程包括：靶区域扩增、PCR产物纯化、第二轮PCR和PCR产物回收。复合扩增以后，我们通过Agilent 2100 Bioanalyzer对DNA文库进行质检，观察接头自连、外援DNA污染等情况，并对PCR产物混样测序。
2.古DNA分析
采用Illumina X10平台进行双端测序（paired-end sequencing），获取读长为150bp的测序数据（fastq）。首先通过cutadapt软件去除接头序列，然后用bwa（version 1.7，参数：mem）将reads与马参考基因组（Equus caballus 2.0，线粒体参考基因组替换为X79547序列）进行比对，生成BAM（Binary Alignment/Map）文件。利用samtools及bcftools对常染色体目标区域进行基因位点分型检测。对于线粒体和性染色体，我们采用bedtools从上一步的BAM文件提取出成功比对到马全基因组的所有reads，再将这些reads采用bowtie2软件参考X79547序列和X、Y染色体参考序列重新比对，生成新的BAM文件。对于第二步的BAM文件，我们用BAMClipper软件，根据引物物理位置从BAM文件去除引物序列得到最终BAM文件。最后，采用samtools(version 1.8)和bcftools(version 1.8)分别对线粒体、X、Y染色体目标区域进行变异位点的识别，生成VCF（Variant Call Format）文件。
三
结果与分析
（一）古蛋白研究部分
本次测试共产生了318种肽链，均属于家马（Equus caballus）。结合胰蛋白酶分析，我们获取了高覆盖率（80%）的家马I型胶原蛋白序列。如表二所示，覆盖率超过30%的肽链中，除了I型胶原蛋白，还检测到家马的其他类型胶原蛋白（III型和V型胶原蛋白）和非胶原蛋白（双糖链蛋白多糖、α2-HS-糖蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白F家族成员1、载脂蛋白A1、软骨蛋白、纤维胶原含NC1结构域蛋白、骨黏连蛋白）。这些肽链都与家马的骨骼形成、发育有关。
表二 覆盖率超过30%的蛋白种类列表
基于I型胶原蛋白数据集，我们采用最大简约法构建了系统发育树（图二），偶蹄类的羊驼作为外类群。系统发生结果显示，本文研究样本阿勒泰依希根殉马与家马I型胶原蛋白的参考序列完全一致，与普氏野马形成一个单系分支，并与其他类群分开。
图二 基于I型胶原蛋白的系统发生树
(*表明阿勒泰依希根殉马与家马I型胶原蛋白的参考序列完全一致)
（二）古DNA研究部分
1.母系线粒体DNA世系与性别鉴定
根据映射在AMEL和SRY上读长的情况，依希根M6墓葬出土的殉马为公马，与动物考古鉴定结果相一致。基于线粒体DNA序列变异模式，依希根M6出土殉马的单倍群属于F1。在现代家马中，谱系F以低到高频（5.2%～23.9%）广泛分布于欧亚大陆，且从东到西逐步递减，其中以东亚的蒙古马（36.4%）和济州马（32.4%）中频率最高。在中国古代家马中，谱系F较为普遍的出现于井沟子遗址（50%）、新店子墓地（33.3%）、雍城血池遗址（30.8%）、大山前遗址（20%）、枣树沟脑遗址（20%）、板城墓地（14.3%）、平顶山墓群（12.5%）等遗址中。[8]
2.父系Y染色体世系
根据已发表的40个区分欧亚大陆不同马的品系的Y染色体SNP，[9]依希根M6出土的殉马有两个突变位点，分别为contig8686:1089T>C、contig1043:691C>T。图三所示，基于家马父系最大简约树，并使用普氏野马和驴的序列作为外群，北欧样本被分为两个分支，分别为N（设得兰矮马和挪威峡湾马）和I（冰岛马），rAX突变定义了一个新的分支，这个分支是I的平行分支，该分支内部包含三个分支（A、S和T），A分支主要包括阿拉伯原始种马、特雷克纳马、德国南部挽马和康尼马拉矮马，S分支为索雷亚马，T分支包含弗朗什山区马、温血马、摩根马、夸特马和标准种马，依希根殉马为rAX突变定义的一个新分支，不属于该支系下的几大分支。可见从父系上，这匹殉马不属于现有欧亚大陆西部常见的家马品种，应该属于欧亚大陆东部的家马品系，与线粒体推断的来源较为一致。此外，欧亚大陆西部品系中具有较高多样性的6个Y-STR标记（Eca.YH12、Eca.YM2、Eca.YP9、Eca.YE1、Eca.YJ10、Eca.YA16），在依希根殉马中未发现突变，其单倍型13-12-17-10-10-23与参考序列完全相同。这与中国现代家马品系调查中所发现的这6个Y-STR突变不具备遗传标记区分力的结论相一致。[10]
图三 家马Y染色体单倍群的系统发生关系图
设得兰矮马（Shetland Pony）；挪威峡湾马（Norwegian Fjord）；冰岛马（Icelandic Horse）；原始阿拉伯马（Original Arabian）；特雷克纳马（Trakehner Horse）；德国南部挽马（South German Draft Horse）；康尼马拉矮马（Connemara Pony）；索雷亚马（Sorraia）；弗朗什山区马（Frenches Montagnes）；温血马（Warmblood Horse）；摩根马（Morgan Horse）；利比扎马（Lipizzan）；夸特马（Quarter Horse）；阿勒泰依希根殉马（Altay Yixigen Horse）；普氏野马（Przewalski’s Horse）
3.体质特征相关位点检测
如表三所示，结合体质特征相关位点的分型结果，我们推测了依希根M6出土殉马的表型特征：1）依希根殉马MC1R（chr3:36259552）位点产生突变（g.36259552C＞T），ASIP（chr22:25168579-25168589）位点产生突变（g.25168579-25168589del）。结合这两个位点和其他毛色基因相关位点的突变情况，综合判定依希根殉马的毛色为栗色；2）依希根殉马MSTN基因在chr18:66493737这个位点上的基因型为TT型，属于该基因型的马耐力更强，更适合长距离奔跑，因此该殉马样本为适合长距离奔跑的耐力型马；3）依希根殉马DMRT3（chr23:22999655）位点的基因型为CC，据研究携带基因野生型的马为不擅长交替步法的四步态马；4）依希根殉马在LCORL（chr3:105547002），HMGA2（chr6:81481064），ZFAT（chr9:75550059）和LASP1（chr11:23259732）四个位点上的基因型分别为TT、AA、CC、GG，ACAN（chr1:94370258）位点的基因型为CC，根据这五个位点的分型结果来看，依希根殉马的体型偏小。此外，该马跖骨全长[11]为25.8厘米，依据日本学者林田重幸、山内忠平对马肩高的推算方法，[12]其肩高为128.1厘米，体型较为矮小，与基因推测体型偏小的结果相吻合。
表三 阿勒泰依希根殉马的基因型与表型特征
四
讨论
1.古蛋白结果的考古学意义
古蛋白分析结果显示，依希根M6出土动物样本为家马。本次研究的意义在于：1）在湿热的环境下（特别是南方），[13]古DNA往往较难保存，相比之下，古蛋白可以在更古老或严酷的环境下存在。因此，在古人类和动物标本关键形态鉴定部位缺失，且古DNA分子没有保存时，古蛋白分析则是快速鉴定种属的有利工具；[14]2）本次研究为中国家马的蛋白质组数据库提供一个高质量数据，可供未来不同时空家马蛋白质组学的比较研究。
2.古DNA结果的考古学意义
从父系Y染色体世系上看，依希根殉马属于rAX大类下，并非欧亚大陆西部常见的家马品种。从母系线粒体DNA世系上看，依希根殉马为F1类型，为欧亚大陆东部常见的家马品系。从推测的体质特征上看，依希根殉马为栗色、耐力型、小型马，这一结果与跖骨全长所推测的马肩高（128.1厘米）相符。综上所述，依希根殉马极有可能是一匹体型较矮的蒙古马。
古DNA方面，除了依据母系遗传谱系和体质特征（特别是身体大小/马肩隆高度），推测陕西省雍山血池秦汉祭祀遗址北斗坊7号长条坑中的26匹幼马很可能大部分是栗色蒙古马[15]之外，其他工作均聚焦于母系遗传谱系和毛色这一表型特征，很难区分西域马和蒙古马。[16]新疆石人子沟遗址出土家马的母系线粒体世系以西北地区频率较高的E谱系（3/5）为主，其次是常见于北亚的A谱系（1/5）和欧亚大陆广泛分布的B谱系（1/5）。石人子沟家马的毛色为栗色（3/5）、骝色（1/5）和金黄色（1/5），其中金黄色马与墓主人同葬于墓室，可能是当时特殊的文化选择，但是该样本是否为西域名驹，仍需验证。新疆木垒县平顶山青铜中晚期墓群出土马骨的DNA研究表明，8匹马分属5个谱系A（3/8）、E（2/8）、D（1/8）、F（1/8）、G（1/8），毛色为栗色（3/8）、栗色越背（2/8）、黑色（1/8）和金黄色（1/8）四种。可见，新疆地区出土家马常见毛色为栗色，母系遗传谱系以A和E为主。本次研究中，依希根M6出土殉马为蒙古草原常见的谱系F，作为蒙古马（栗色、耐力型、小型马）出现在阿勒泰地区的隋唐墓中，值得深入探讨。
西域一直是中原地区引进优良马种的首选之地，极大地促进了内地养马业的发展。以往研究认为，唐代西域的畜牧经济中饲养主要是高大体型的马，以高大神骏为特色，“鹄颈”“凤膺”或背有双脊、头部干燥轻巧、骑挽兼用；[17]依希根M6殉马的发现证明，隋唐时期这一地区已经出现了蒙古马。这种马马头大、脖子粗、躯干长、四肢较短，体高120～135厘米为最多，毛色复杂，吃苦耐劳、耐力极强。考虑到大唐战马主要是与北方游牧族群“互市”，说明这一时期进入中原腹地的马已包括蒙古草原品系和西域品系。唐昭陵六骏中，[18]什伐赤头大、个矮为蒙古草原马，有类似“三花”剪法的鬃毛，青骓背有两条肉脊，极有可能来自西域；特勤骠为一匹拥有特勤称号的浅黄色战马，形象健壮、长腿小腹，可能是西域大宛马；飒露紫高大魁伟，头小臀肥，应非蒙古马；拳毛騧头部硕大、高鼻梁、身材不高，属于蒙古骏马种系；白蹄乌也是头大高鼻、四肢不长，很可能是蒙古马。也就是说，昭陵六骏中至少有三骏属于蒙古草原马。
游牧人群对于马的习性和用途了然于胸。相比西域马，蒙古马因其体型矮小，行动灵活，善走山路，更适合在山区、半山区饲养。新疆阿勒泰地区位于阿尔泰山南麓，北部山区占境内一半。隋唐时期阿勒泰地区的畜牧人群选择饲养蒙古矮马，既可当坐骑，又能拉车和负重，这是一种适合山区生活的选择。
五
结论
通过对新疆阿勒泰地区依希根墓地出土马骨的分子考古研究，包括涉及样本种属鉴定的古蛋白质检测，以及遗传谱系（父系Y染色体和母系线粒体）和生理特征推断（毛色、运动能力、步态、体型/肩高、高原适应等）的古DNA检测，并结合历史文献，我们获得如下认识：
1.本研究为在国内首次对东亚古代家马进行古蛋白质组学检测。依希根殉马样本产生了318种肽链，均属于家马（Equus caballus）。基于I型胶原蛋白数据集的系统发育树也同样支持这一结果。本研究为中国家马蛋白质组学数据库提供了一个质量较好的组学数据，可供后续比较研究。
2.本研究为在国内首次对东亚古代家马样本进行Y染色体提取并分型。通过比对，在欧亚大陆西部能够区分不同品系的Y染色体SNP和STR位点，在依希根殉马中均没有发现相应突变。因此，我们推测依希根殉马的Y染色体可能属于欧亚大陆东部家马的谱系。这个认识为中国古代家马的Y染色体谱系研究提供了重要的启示。
3.母系线粒体结合体质特征推断表明，依希根殉马可能为栗色蒙古马（线粒体谱系F1、毛色栗色、耐力型、四步态、小型马）。出土跖骨全长所推测的马肩高为128.1厘米，符合蒙古马的常见体高范围（120～135厘米）。西域盛产良驹，如乌孙马、大宛马、龟兹马、于阗马等，均高大威风，一直都是“西马东传”的要地。蒙古草原系马匹出现在阿勒泰地区的隋唐墓中，可能是当地人有意识地将蒙古马引入阿勒泰山区，充分发挥矮马在山路上行走敏捷稳健的特点。
致谢：感谢新疆文物考古研究所为本研究提供了宝贵的样本；感谢复旦大学科技考古研究院袁靖教授、中国文化遗产研究院葛承雍教授、中国科学技术大学科技史与科技考古系王娟副研究员建设性的修改意见。
滑动查阅
[1]本课题为国家社科基金重大项目 “三到九世纪北方民族谱系研究”（项目编号：20&ZD212） 的阶段性成果。
[2]余辉：《画马两千年》，商务印书馆，2014年，第17～19页。
[3]参见：Buckley M.，Collins M.，Tomas-Oates J.，et al.，“Species Identification by Analysis of Bone Collagen Using Matrix-assisted Laser Desorption/ionization Time-of-fight Mass Spectrometry”，Rapid Communications in Mass Spectrometry，23，2009，pp.3843-3854.Presslee S.，Wilson J.，Woolley J.，et al.，“The Identification of Archaeological Eggshell Using Peptide Markers”，STAR：Science & Technology of Archaeological Research，4，2018，pp.13-23.
[4] Rao H.，Yang Y.，Liu J.，et al.，“Palaeoproteomic Analysis of Pleistocene Cave hyenas from East Asia”，Scientific Reports，10，2020，p.16674.
[5] Wilson D E.，Reeder D M.， Mammal Species of the World.A Taxonomic and Geographic Reference，Baltimore：Johns Hopkins University Press，2005，p.2142.
[6] Knapp M.，Clarke A C.，Horsburgh K A.，et al.，“Setting the Stage - building and Working in an Ancient DNA Laboratory”，Annals of Anatomy，194.1，2012，pp.3-6.
[7] Rohland N.，Glocke I.，Aximu-Petri A.，et al.，“Extraction of Highly Degraded DNA from Ancient Bones，Teeth and Sediments for High-throughput Sequencing”，Nature Protocols，13.11，2018，pp.2447-2461.
[8]参见文少卿等：《古基因组学在古代家马研究中的应用》，《第四纪研究》 2020年第40卷第2期，第307～320页。 Cai D.，Tang Z.，Han L.，et al.，“Ancient DNA Provides New Insights into the Origin of the Chinese Domestic Horse”，Journal of Archaeological Science，36.3，2009，pp.835-842.
[9] Wallner B.，Palmieri N.，Vogl C.，et al.“Y Chromosome Uncovers the Recent Oriental Origin of Modern Stallions”，Current Biology，27.13，2017，pp.2029-2035.
[10]凌英会：《中国主要地方马群体遗传多样性及系统进化研究》，中国农业科学院博士论文， 2010年6月，第86～96页。
[11] 〔德〕安格拉·冯登德里施著；马萧林，侯彦峰译：《考古遗址出土动物骨骼测量指南》， 科学出版社，2007年，第108～109页。
[12] 〔日〕林田重幸，山内忠平：《馬における骨長より体高の推定法》，《鹿児島大学農学部学術報告第6号》，昭和32年12月，第146～156页。
[13] Smith C I.，Chamberlain A T.，Riley M S.，et al.，“The Thermal History of Human Fossils and the Likelihood of Successful DNA Amplification”，Journal of Human Evolution，45，2003，pp.203-217.
[14]参见Nielsen-Marsh C M.，Ostrom P H.，Gandhi H.，et al.，“Sequence Preservation of Osteocalcin Protein and Mitochondrial DNA in Bison Bones Older than 55 ka”，Geology，30，2002，pp.1099-1102.Taylor W.，Wang J.，Hart I.，“Understanding the Prehistory of Domestic Animals in East and Central Asia Through Scientific Archaeozoology”，Journal of Archaeological Science：Reports，32，2020，p.102397.
[15]文少卿等： 《凤翔雍山血池遗址北斗坊7号坑马骨的古DNA研究》，《考古与文物》2020年第6期，第115～121页。
[16]参见蔡大伟等：《内蒙古赤峰地区青铜时代古马线粒体 DNA 分析》，《自然科学进展》2007年第17卷第3期，第385～390页。陈曦：《陕西凤翔秦公一号大墓车马坑马骨遗骸古DNA研究》，吉林大学硕士论文，2014年6月，第8～16页。赵欣等：《陕西省淳化县枣树沟脑遗址马坑出土马骨的DNA初步研究》，《南方文物》2015年3期，第70～76页。赵欣等：《新疆石人子沟遗址出土家马的DNA研究》，《第四纪研究》2014年第34卷第1期，第187～195页。赵欣等：《新疆木垒县平顶山墓群出土马骨的DNA研究》，《南方文物》2017年第3期，第187～191页。 Cai D.，Tang Z.，Han L.，et al.，“Ancient DNA Provides new Insights into the Origin of the Chinese Domestic Horse”，Journal of Archaeological Science，36.3，2009，pp.835-842.
[17]参见侯丕勋：《汗血宝马研究 西极与中土》，甘肃文化出版社，2016年，第83～88页。Emel Esin，“The Horse In Turkic Art”，Central Asiatic Journal，10.4，1965，pp.167-227.
[18]参见葛承雍：《唐昭陵六骏与突厥葬俗研究》，《中华文史论丛》第60辑，1999年，第182～209页。刘炘：《中国马文化 驯养卷》，甘肃人民美术出版社，2019年，第216～217页。
（作者单位：文少卿 复旦大学科技考古研究院；于建军 新疆文物考古研究所；魏偏偏、熊建雪、孙畅、杜盼新、丁一、蒙海亮 复旦大学现代人类学教育部重点实验室；李悦 西北大学文化遗产学院）
编校：杨春红
审校：王文洲
审核：陈 霞
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