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作者：程东良 董跃丽 申志强 邢燕 靳垚 史长松 杨中文通信作者：杨中文，Email：577080912@qq.com作者单位：河南省人民医院（郑州大学人民医院）儿童重症监护病房，郑州 450000本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(18):1398-1402.引用本文：程东良,董跃丽,申志强,等.miR-424对脓毒症并急性呼吸窘迫综合征患儿早期诊断及预后评估的价值[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(18):1398-1402.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20220224-00194.
摘要
目的 探讨miR-424对脓毒症并急性呼吸窘迫综合征（ARDS）风险的预测价值及其与ARDS预后的相关性。方法 前瞻性研究。收集2020 年2 月至2021 年2 月河南省人民医院（郑州大学人民医院）收治的脓毒症患儿（含ARDS）资料，记录患儿ARDS发生情况和ARDS患儿病死率,ARDS患儿根据是否死亡分为存活组和死亡组。采用定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测患儿外周血单个核细胞miR-424的表达。采用Pearson相关分析探讨ARDS患儿miR-424表达与儿童危重症评分（PCIS）、序贯器官衰竭(SOFA)评分、氧合指数（P/F值)、C反应蛋白(CRP)、降钙素原（PCT）、炎症因子白细胞介素（IL）-6和IL-8等之间的关系。采用多因素Logistic回归分析影响ARDS患儿预后的因素。采用受试者工作特征曲线(ROC)评估miR-424对脓毒症并ARDS早期诊断的准确性，评估miR-424对脓毒症并ARDS组患儿死亡的风险。结果 共纳入脓毒症患儿121例，其中并ARDS组36例。脓毒症并ARDS组患儿miR-424表达(0.56±0.17)明显低于脓毒症不并ARDS组(0.98±0.26)（t=8.776，P<0.001）。脓毒症并ARDS组患儿miR-424表达与IL-6(r=-0.627，P<0.01）、IL-8(r=-0.651，P<0.01）及CRP(r=-0.472，P<0.05）水平均呈负相关；与PCIS评分(r=0.330，P<0.05)、P/F值(r=0.592，P<0.001)、白蛋白(r=0.496，P<0.05)均呈正相关。ROC显示，miR-424［曲线下面积(AUC)=0.908,95%CI:0.856~0.960］能够区分脓毒症并ARDS患儿和脓毒症不并ARDS患儿。与ARDS存活组相比，ARDS死亡组miR-424明显下降(0.42±0.14比0.63±0.15)(t=3.890，P<0.05)；miR-424(AUC=0.845,95%CI:0.696~0.995)降低预示ARDS患儿死亡风险增加。多因素Logistic回归分析显示，miR-424 表达（OR=0.001，P=0.033 ）、白蛋白（OR=0.553，P=0.040）为ARDS患儿死亡的独立危险因素。结论 miR-424对脓毒症并ARDS患儿的早期诊断和ARDS预后判定有预测价值。
关键词
miR-424；急性呼吸窘迫综合征；诊断；预后
脓毒症是机体对感染的反应失调，导致危及生命的器官功能障碍，是重症监护室患者常见死亡原因［1］。急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是脓毒症最为严重的肺部并发症，脓毒症时促炎与抗炎因子失衡所诱发的免疫炎症反应是ARDS 产生的重要原因［2］，可导致脓毒症患者病死率升高［3］。研究发现，miR-424升高可抑制淋巴细胞和中性粒细胞的炎症反应，从而影响急性卒中［4］。本课题组前期研究发现，在细胞水平，miR-424通过靶向成纤维细胞生长因子2（FGF2）调节脂多糖（LPS）诱导的肺泡上皮细胞的白细胞介素(IL)-6、IL-8的表达［5］。miR-424 表达情况与脓毒症相关的ARDS在临床上是否有相关性，仍然未知。本研究分析脓毒症相关的ARDS患儿的临床资料和外周血单个核细胞中miR-424的表达，探讨miR-424对脓毒症并ARDS风险的预测价值及其与ARDS预后的相关性。
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资料与方法1.1 研究对象 前瞻性研究。收集2020年2月至2021年2月河南省人民医院（郑州大学人民医院）收治的脓毒症患儿（含ARDS）资料。28 d<患儿年龄<18岁，患儿均符合2020版拯救脓毒症运动国际指南中的儿童脓毒症休克和脓毒症相关器官功能障碍管理诊断标准［6］。排除标准：1个月内使用过丙种球蛋白；监护人不同意入组者、长期使用糖皮质激素者；有肿瘤、结缔组织病等基础疾病者。本研究通过医院医学伦理委员会批准（批准文号：2019伦理第112号），并获得患儿监护人知情同意。1.2 方法 1.2.1 一般资料 记录患儿性别、年龄、现病史、既往史、个人史、家族史等。收集患儿C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、降钙素原（procalcitonin，PCT）、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白蛋白、D-二聚体等检查结果。记录患儿入儿童重症监护室（PICU）期间有无机械通气、机械通气方式，入PICU 24 h内儿童危重症评分（PCIS）、序贯器官衰竭评分（SOFA评分）、氧合指数（P/F值)，急性病程中CRP、PCT、IL-6、IL-8、白蛋白、D-二聚体水平，PICU住院时间、疾病转归等。1.2.2 分组 根据患儿是否合并ARDS，分为脓毒症并ARDS组和脓毒症不并ARDS组，ARDS诊断标准参考国际小儿急性呼吸窘迫综合征专家共识中的诊断标准［7］。脓毒症并ARDS组根据患儿转归分为存活组和死亡组。1.2.3 miR-424测定 诊断脓毒症24 h内留取患儿空腹外周静脉血3 mL,置乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，倒入离心管内，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀，室温放置5 min,4 ℃ 3 000 r／min离心10 min(离心半径10 cm)；吸取上层血浆，下层血细胞加入等体积的磷酸盐缓冲液稀释，缓慢加入同体积的淋巴细胞提取液，4 ℃，2 000 r／min慢升、慢降离心20 min(离心半径10 cm)，血浆层和分离液层之间的为外周血单核细胞，留取外周血单核细胞。采用Trizol、氯仿等提取出各组细胞总RNA。使用特异性miR-424及U6 RT引物反转录得到cDNA，U6为内参。引物序列：miR-424-正向引物GCGCGTAGCTTATCAGACTGA；miR-424-反向引物AGTGCAGGGTCCGAGGTATT；U6-正向引物CTCGCTTCGGCAGCACA；U6-反向引物AACGCTTCACGAA-TTTGCGT。反应体系:cDNA（1∶20）5.0 μL，正向引物 0.5 μL，反向引物 0.5 μL，SYBR Green PCR Master Mix 10.0 μL,H2O 4.0 μL，共20.0 μL。反应条件：95 ℃，5 min；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；72 ℃，32 s读取荧光，40 个循环。每个样本重复 3 次。miR-424的相对表达量以2-△△Ct表示［8］。1.3 统计学处理 采用SPSS 23.0软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料以x̄±s表示，组间比较采用t检验，非正态分布的计量资料用M（范围）表示，组间比较采用Mann-Whitney U非参数检验，计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher′s确切概率法。应用Logistic回归分析脓毒症患儿并发ARDS的危险因素以及影响ARDS患儿预后的因素。通过Pearson相关分析探讨脓毒症合并ARDS组患儿的miR-424相对表达量与PCIS、SOFA、P/F值、CRP、PCT、IL-6和IL-8等之间的相关性。采用受试者工作特征曲线（ROC）评估miR-424对脓毒症合并ARDS诊断的准确性及其预测脓毒症合并ARDS组患儿病死的风险。P<0.05为差异有统计学意义。
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结果2.1 一般资料 共纳入脓毒症患儿121例，其中脓毒症并ARDS组36例，男21例，女15例，年龄（8.15±3.74）岁；脓毒症不并ARDS组85例，男57例，女28例，年龄（5.87±2.74）岁。与脓毒症不并ARDS组相比，脓毒症并ARDS组患儿SOFA评分、CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α、D-二聚体水平较高，PCIS评分、P/F值、白蛋白水平较低，差异均有统计学意义（均P<0.05），结果见表1。经治疗后，2组患儿结局有显著差异，脓毒症并ARDS组患儿病死率更高［11/36例（30.6%)比12/85例（14.1%)］（χ2=4.439,P=0.035）。
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讨论ARDS是由各种原因引起肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞损伤所导致的一种以非心源性肺水肿和严重低氧血症为特点的严重呼吸衰竭［9-10］。目前，ARDS发病机制尚不完全清楚，尽管随着肺保护性通气策略等治疗手段的进步，儿童ARDS的预后有所改善,但由于缺少特效的治疗手段，ARDS仍是PICU患儿死亡的重要原因。因此，如何早期预测ARDS的患病风险及病情的严重程度，早期判定ARDS患儿的预后，进而予个体化治疗，对于改善ARDS患儿的预后及降低死亡率具有重要临床意义。微小RNA（miRNA）是一类广泛存在于真核生物中的长约 21～25 碱基的非编码小分子RNA，其以不完全互补的方式和靶基因的3′端非编码区序列相结合，通过抑制蛋白质的翻译发挥生物学功能。miRNA通过这种作用机制抑制靶基因的表达,进而在关键蛋白质合成、神经细胞发育、肿瘤发生、细胞凋亡和炎症相关的各种疾病等方面发挥重要作用。miRNA机制研究可能是基因、蛋白水平有关ARDS发病机制及治疗研究的重要补充。在急性肺损伤（ALI）/ARDS领域中，识别与该综合征相关的miRNAs，不仅有助于理解其所涉及的病理生理机制，而且有助于确定潜在的治疗靶点。本研究显示,miR-424在脓毒症并ARDS组低表达，差异有统计学有意义（P<0.001）。且miR-424在脓毒症并ARDS组患儿的表达量与PCIS评分、P/F值、白蛋白呈正相关，与CRP、IL-6、IL-8呈负相关。miR-424可通过核因子κB（NF-κB）途径调节肺泡上皮细胞的凋亡和炎症反应，在ARDS过程中发挥作用［5］。本研究显示，并发ARDS的脓毒症患儿具有更高水平的CRP、PCT、IL-8、IL-6、D-二聚体，更低水平的白蛋白。当正常的内皮屏障被破坏时，肺泡-毛细血管通透性增加，炎症细胞及炎症介质大量渗入细胞外基质，导致肺泡水肿，使肺泡清除率进一步下降，加重肺损伤的同时也加速了白蛋白渗入第三间隙及肺泡，表现为低蛋白血症［11］。CRP主要由肝脏合成，机体遭受感染、创伤、手术以及心脑血管事件时其表达水平显著升高，在一定程度上反映机体炎症水平［12］。研究显示，PCT 是影响 ARDS 氧化应激反应的重要指标，PCT 水平越高，其对于下游线粒体能量利用障碍等的影响越显著，肺泡 Ⅱ 型上皮细胞的功能损伤越严重［13］。D-二聚体是评估患者凝血功能评估的重要指标，在过度激活的纤维蛋白溶解系统中 D-二聚体可显著上升，同时导致局部肺组织血管微血栓形成，加剧通气血流比值异常,增加肺通气等障碍。有研究报道,ARDS 患者血液循环状态及心脏功能与D-二聚体密切相关，并指出积极应用血管活性物质调节血浆D-二聚体水平对恢复ARDS患者循环功能具有重要意义［14］。关于PICU中ARDS的发病率和死亡率，不同研究中心的差异较大。2009年Yu等［15］报道我国PICU中ARDS发生率为1.44%，病死率为61%，肺炎(55.2%)和脓毒症 (22.9%) 是其主要危险因素。2019年Wong等［16］通过Meta分析发现，ARDS在PICU中的发生率为 1%~4%，病死率为22%~65%。本研究结果显示，未并发ARDS的脓毒症患儿的病死率为14.1%，并发ARDS者显著上升至30.6%。提示在脓毒症患儿的救治管理中，应严密监测评估有无ARDS的发生，早期进行干预，以降低患儿发生不良预后的可能性。本研究采用ROC判定外周血miR-424的表达在脓毒症并ARDS诊断中的准确性，结果显示miR-424预测脓毒症并ARDS的曲线下面积为0.908，敏感性为0.889，特异性为 0.812。miR-424可用于ARDS患儿的早期诊断。本研究还发现，miR-424能非常好地预测ARDS患儿的预后，曲线下面积为0.845，敏感性为0.818，特异性为0.840，且miR-424在ARDS死亡组低表达，miR-424是脓毒症并ARDS组患儿死亡的独立危险因素。综上，临床上对于PICU的脓毒症患儿，除关注危重症临床指标外，可同时监测外周血中miR-424的表达，以早期发现ARDS的风险，提高临床医师对脓毒症患儿并发ARDS的警惕性。同时miR-424对于评估儿童ARDS的预后也有较高的临床价值。但本研究尚处于起步阶段，仍需进一步临床验证miRNA的价值。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
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