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作者：赵佳琛 刘医萌 彭晓旻 崔淑娟 卢桂兰 石伟先 马春娜 李夫 张代涛 王全意 杨鹏通信作者：彭晓旻，Email：xminp0402@sina.com作者单位：北京市疾病预防控制中心传染病地方病控制所，北京 100013本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(21):1645-1650.引用本文：赵佳琛,刘医萌,彭晓旻,等.北京市儿童A族链球菌emm基因型别及药敏特征变化分析[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(21):1645-1650.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20220321-00296.
摘要
目的 了解北京市儿童A族链球菌（GAS）M蛋白基因（emm基因）型别及药敏特征变化。方法 回顾性研究。收集2018年、2019年、2021年北京市16区猩红热病原学监测哨点医院儿童临床诊断猩红热及咽部感染病例咽拭子样本分离的GAS菌株。采用PCR扩增及测序进行emm基因分型，采用微量肉汤稀释法测定10种抗生素最低抑菌浓度（MIC）。采用χ2检验和Fisher′s确切概率法进行组间比较。结果 共收集GAS菌株557株，检测到11种emm基因型（emm1、emm3、emm4、emm6、emm11、emm12、emm22、emm75、emm89、emm128、emm212）。其中emm1型42.73%（238/557株），emm12型48.65%（271/557株），其他emm 型8.62%（48/557株）。emm1、emm12、其他emm型2018年分别为37.50%（105/280株）、57.14%（160/280株）、5.36%（15/280株）；2019年分别为49.05%（129/263株）、39.54%（104/263株）、11.41%（30/263株）；2021年分别为28.57%（4/14株）、50.00%（7/14株）、21.43%（3/14株）。2018年和2019年≤6岁儿童组中感染emm12型的构成比均高于>6岁儿童组（62.50%比46.88%，46.36%比30.36%），差异均有统计学意义（χ2=7.182、6.973，均P<0.05）。选取225株GAS进行药敏检测，结果对青霉素、左氧氟沙星、美罗培南、利奈唑胺、头孢噻肟、头孢吡肟、万古霉素7种抗生素敏感率均为100.00%，对红霉素、四环素、克林霉素的耐药率分别为：2018年88.57%（93/105株）、87.62%（92/105株）、86.67%（91/105株）；2019年94.34%（100/106株）、94.34%（100/106株）、87.74%（93/106株）；2021年3种抗生素耐药率100.00%（14/14株）。2018年青霉素MIC50、MIC90均为0.03 mg/L；2019年分别为0.03 mg/L、0.06 mg/L；2021年均为0.06 mg/L。225株GAS中207株存在耐药，且均为联合耐药，红霉素-四环素-克林霉素三重耐药占94.69%(196/207株)，红霉素-克林霉素双重耐药占4.35%(9/207株)，红霉素-四环素双重耐药占0.97%(2/207株)。结论 北京市2018年、2019年、2021年儿童GAS的emm基因型别多样，优势基因型为emm12与emm1，以emm12为主导流行型别。GAS菌株对红霉素、克林霉素、四环素维持较高耐药率，对青霉素等抗生素保持敏感，但青霉素MIC50和MIC90呈递增趋势。
关键词
A族链球菌；emm基因；药敏试验；儿童
A族链球菌（Group A Streptococcus,GAS）是一种重要的人类儿童病原体。GAS除引起猩红热散发和暴发流行外，还常引起咽/扁桃体炎、皮肤软组织感染，严重者可引起侵袭性疾病，如坏死性筋膜炎、链球菌感染中毒性休克综合征、风湿热及急性链球菌肾小球肾炎等，疾病负担严重［1-2］。GAS感染以青霉素等β-内酰胺类药物为临床治疗首选，具有较好的敏感性，但对作为替代药物红霉素等大环内酯类抗生素的耐药情况严重［3］。了解GAS对不同抗生素敏感性和耐药谱变化可有效指导儿科临床合理用药。GAS菌株M蛋白的emm基因分型技术广泛应用于分子流行病学调查，对了解emm型别分布变化，掌握疾病流行趋势，及时调整防控策略意义重大［4-5］。本研究对北京市2018年、2019年、2021年猩红热病原学监测工作中分离的儿童GAS菌株进行emm基因分型和药敏检测和回顾性分析，了解GAS的emm型别分布和药敏特征变化，为疾病防控和临床用药提供依据。
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资料与方法1.1 菌株来源 按照北京市猩红热病原学监测方案，采集2018、2019、2021年5月至7月北京市16区辖区内16家猩红热病原学监测哨点医院（1家/区）临床诊断猩红热（疑似/临床诊断/实验室确诊）及咽部感染（链球菌感染/扁桃体炎/咽峡炎）儿童病例咽拭子分离GAS菌株（2020年因新冠疫情原因未开展猩红热监测工作）。1.2 试剂及仪器 哥伦比亚血平板链球菌 A~F 分群鉴定试剂盒购自英国 Oxoid 公司，VITEK-2 全自动微生物分析系统、革兰阳性菌生化鉴定卡购自法国生物梅里埃公司；96 孔革兰阳性需氧菌微量肉汤稀释法药敏检测板购自上海星佰生物技术有限公司；PCR扩增用Taq酶、dNTP购自大连宝生物工程有限公司，DNA提取试剂购自上海之江生物科技股份有限公司。1.3 方法 1.3.1 菌株分离与鉴定 采集病例咽拭子标本，12 h内接种于哥伦比亚血琼脂平板，划线分离，37 ℃、50 mL/L二氧化碳培养箱中培养12～14 h，挑取β型溶血可疑单个菌落，分纯培养后革兰染色，革兰阳性链状球菌经GP生化鉴定卡、VETEK-2全自动微生物分析系统鉴定。用链球菌A～F血清分群试剂鉴定为A群。1.3.2 emm基因型别测定 根据美国疾病预防控制中心方法进行（https://www.cdc.gov/streplab/groupa-strep/emm-typing-protocol.html)。扩增引物1：5′-TATT(C/G)GCTTAGAAAATTAA-3′、扩增引物2：5′-GCAAGTTCTTCAGCTTGTTT-3′、测序引物：5′-TATTCGCTTAGAAAATTAAAAACAGG-3′。PCR扩增体系为Buffer 5 μL，dNTP 1.5 μL，引物1 0.5 μL，引物2 0.5 μL，Taq酶 0.5 μL，H2O 37 μL，模板DNA 5 μL，反应条件95 ℃ 5 min，95 ℃ 20 s、50 ℃ 45 s、72 ℃ 90 s，循环30次，72 ℃ 5 min。PCR扩增产物委托上海英潍捷基生物技术有限公司进行纯化和基因序列测定。序列提交美国疾病预防控制中心网站（https://www2a.cdc.gov/vaccines/biotech/strepblast.asp），比对获得emm基因型及亚型。1.3.3 抗生素敏感性试验 挑取适量新鲜GAS分纯菌落数个，置2~3 mL灭菌9 g/L盐水中，配制0.5麦氏单位的菌悬液，取60 μL该菌悬液和600 μL无菌马血清，加入到12 mL营养肉汤培养液中混匀。吸取该稀释菌液各100 μL，加入96孔革兰阳性需氧菌药敏检测板，此药敏板包含10种抗生素（左氧氟沙星、青霉素、美罗培南、利奈唑胺、红霉素、克林霉素、万古霉素、四环素、头孢噻肟、头孢吡肟），每次实验设立阴、阳性对照，具体操作步骤及最低抑菌浓度（MIC）结果判定方法见96孔革兰阳性需氧菌微量肉汤稀释法药敏检测板试剂盒说明书，根据美国临床实验室标准化委员会（CLSI）颁布的M100-S26标准［6］获得相应敏感（S）、中介（I）和耐药（R）结果，计算MIC50和MIC90。1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0软件进行统计分析，WPS表格软件绘制图表。数据采用株（%）描述，应用χ2检验和Fisher′s确切概率法进行组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。
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结果2.1 一般情况 2018年、2019年、2021年共采集病例咽拭子5 594份，分离GAS菌株557株。2018年、2019年、2021年中，来源于临床诊断猩红热病例咽拭子样本分别为197份、177份、82份，阳性分离率分别为41.12%（81/197份）、35.59%（63/177份）、6.10%（5/82份）；来源于咽部感染病例咽拭子样本分别为2 097份、2 285份、756份，阳性分离率分别为9.49%（199/2 097份）、8.75%（200/2 285份）、1.20%（9/756份）。GAS菌株分布特征见表1。
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讨论emm基因分型是近年来国内外GAS广泛应用的分子分型方法，目前emm基因型别达245种［7］。不同国家和地区GAS的emm基因流行的型别不同，存在地域差异。emm1型是德国、美国、澳大利亚和日本最流行的型别［8-9］，而希腊［10］、芬兰［11］、葡萄牙［12］等国家emm基因流行型别包括emm1、emm3、emm12、emm6、emm28、emm77和emm89，型别多且分布较平均。冰岛［13］以emm4、emm6和emm12为主。本研究2018年、2019年、2021年GAS以emm12和emm1为主要基因流行型别，与我国其他地区和北京市既往报道的结果一致［14］。结合本研究与既往报道［5］，北京市在2011年至2021年emm1和emm12交替成为主导基因型别，且以emm12为主导年份稍多，但二者整体占比下降。这种动态变化可能与其M蛋白特异性抗体或GAS的基因片段发生改变或本市易感人群已建立针对emm1和emm12的区域群体免疫有关。值得警惕的是，本研究检测出其他emm型别，如emm3、emm6、emm212，是既往北京市监测中未发现的基因型。其他emm型别占比与以往监测结果不同，本研究的3年检测比例结果分别为5.36%、11.4%、21.43%，2011年至2017年［15-16］在0～2.5%，表明其他emm型别占比有逐年增加的趋势。同时检测出emm1基因亚型11种，emm12基因亚型22种，北京市既往报道［15］检出emm1基因亚型5种，emm12基因亚型17种。因此，北京市GAS菌株不仅emm型别增多，亚型也在逐年增多。反映了北京市呼吸系统GAS菌株的多样化。由于没有对新型别的群体免疫力，北京市人群面临由这些类型引起的猩红热流行的高风险。本次分析还发现在2018年和2019年，emm12在≤6岁组患儿中构成比高于>6岁组。证实了既往报道的emm12型随年龄增加呈下降的趋势［15］。产生此现象的原因或许为emm12型感染机体后所产生的特异性抗体与其他型别不同，是否可长期存在机体内有待进一步研究。持续监测emm基因型和亚型可掌握本地区GAS的流行趋势，及时发现本地未出现的型别及亚型，及时调整防控策略。同时为多价GAS疫苗研发的基因型别选择提供依据。目前GAS感染预防尚无相关商品化疫苗，临床治疗中青霉素等β-内酰胺类抗生素是治疗GAS感染的首选药物，疗效好成本低，红霉素等大环内酯类抗生素作为替代药物。2001年墨西哥首次报道有5%的GAS菌株对青霉素产生耐药［17］，随后全球多国均有报道［18］。本研究结果显示，225株GAS菌株对青霉素等β-内酰胺类抗生素全部敏感，与我国既往研究结果一致［19-21］。但值得注意的是，本研究中青霉素MIC50与MIC90均有上升趋势，由2018年的0.030 mg/L上升到2021年的0.060 mg/L，而北京市既往报道［3］青霉素MIC50与MIC90维持在0.015 mg/L，提示青霉素长期使用或滥用有可能导致其敏感性持续下降甚至耐药。自20世纪50年代末英国［22］首次报道红霉素等大环内酯类抗生素耐药以来，耐药问题已在世界各国发现，耐药率存在时间和地域差异，如波兰、意大利、葡萄牙和西班牙等国家大环内酯类抗生素的耐药率较高，美国、澳大利亚、土耳其、瑞典和瑞士等国家的耐药率较低［23］。韩国［24］等国家GAS的耐药率逐年下降。印度［18,25］等一些国家耐药率持续增加。我国红霉素、克林霉素和四环素耐药率居高不下，本研究中GAS对红霉素、克林霉素、四环素的耐药率均>86%，且有逐年上升趋势，这与我国其他省份报道结果相似［26-28］。近年来大环内酯类、林可霉素类、四环素类基本药物使用率均有下降，但大环内酯类药物仍为呼吸系统疾病使用占比最高的药物之一［29］，与其耐药率居高不下存在一定关系。有研究指出GAS的耐药水平不仅与抗生素过量使用有关，也与当地广泛流行较高水平耐药菌株有关［6］，提示应在今后加强耐药基因与本地流行菌株间关系的研究和探讨。本研究耐药模式显示225株GAS中207株存在耐药，且均为联合耐药，2018年至2021年均以红霉素-四环素-克林霉素三重耐药模式为主，其次为红霉素-克林霉素双重耐药，最后为红霉素-四环素双重耐药，与既往研究结果［19］相似，说明北京市多重耐药情况严重。其原因可能与部分患儿存在抗生素滥用情况相关。有文献表明，我国儿科45.4%～89.7%的患儿接受至少1种及1种以上的抗生素治疗［30-31］，随着抗生素的不合理使用，GAS耐药甚至联合耐药菌株逐渐增加。2021年因新型冠状病毒肺炎的严格防控措施遏制了多种呼吸道传染病在人群中的传播，导致呼吸道病原体检出率下降，文献［32］中也有相关报道。因此2021年本市猩红热病原学监测的菌株分离率较往年存在大幅下降，全部菌株仅14株，存在一定局限性。综上，2018年、2019年、2021年北京市儿童GAS流行emm基因型别多样，优势基因型为emm12与emm1，以emm12为主导流行型别。2018年和2019年emm12在≤6岁组患儿中构成比高于>6岁组。药敏监测显示GAS对青霉素等β-内酰胺类抗生素敏感性较好，对红霉素等大环内酯类抗生素存在较高耐药。耐药模式以红霉素-四环素-克林霉素三重耐药为主。通过加强GAS药敏监测，合理使用抗生素，可减少耐药菌株和多重耐药菌株产生。持续对GAS的emm基因型别动态变化和抗生素药敏特征监测，可为GAS感染相关疾病防控和临床合理用药提供实验室依据。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
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