点击蓝字 关注我们
作者：高外外 禹定乐 王文建通信作者：王文建，Email:wwjxx@126.com作者单位：中国医科大学深圳市儿童医院呼吸科,深圳 518038本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(21):1655-1659.引用本文：高外外,禹定乐,王文建.深圳市2016年至2018年猩红热A族链球菌emm基因型及基因组多态性分析[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(21):1655-1659.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20220719-00881.
摘要
目的 明确导致猩红热的A族链球菌(GAS)流行型别，比较不同emm型别GAS的基因结构及基因变异性，阐明猩红热病原学的流行、进化规律。方法 回顾性研究。收集2016年1月1日至2018年5月31日深圳市儿童医院诊断为猩红热的儿童咽拭子标本，保存GAS菌株，进行emm基因分型，选取在分型上具有代表性的菌株进行全基因组测序，通过比较基因组学分析，描述GAS菌株基因组多态性，并基于单核苷酸多态性（SNP）位点分析构建遗传进化树，阐明菌株之间的进化关系。2组比较采用秩和检验。结果 在导致儿童猩红热的176株GAS分离株中，共检测到8种emm型别，emm12.0 及其亚型(108/176株,61.4%)占比最高，其次为emm1.0 及其亚型(53/176株,30.1%)，两者共占91.5%。以GCA-900984775为参考序列进行比较基因组分析显示，GAS菌株基因组之间存在丰富的SNP和插入或缺失（InDel）多态性，emm12.0 型菌株SNP数［183(163,213)个］大于emm1.0 型菌株SNP数［63（54,75）个］，差异有统计学意义（P<0.05）;InDel分析中，emm12.0 型菌株基因序列插入数［4(3,6)个］和缺失数［8(6,10)个］大于emm1.0 型菌株［1(0,2)个，5(3,7)个］。以MGAS5005参考序列，基于 SNP 的分析结果构建进化树得出18株菌株及参考菌株处于2个分支。结论 引起儿童猩红热的GAS菌株型别以emm12.0型、emm 1.0型多见，不同型别菌株基因组组成之间存在差异，emm12.0 型菌株存在较高的遗传多样性。
关键词
猩红热；A族链球菌；emm分型；基因组多态性；儿童
A族链球菌(Group A Streptococcus，GAS)是导致儿童感染性疾病的病原菌之一，GAS除可引起咽炎、扁桃体炎、皮肤化脓性感染外，还可引起坏死性筋膜炎等侵袭性疾病以及风湿热、肾小球肾炎等免疫性疾病［1-2］。猩红热为GAS所致疾病中常见的病种之一，具有传染性，易引起暴发流行，且易导致链球菌中毒性休克综合征（streptococcal toxic shock syndrome,STSS）、败血症等并发症［3-4］。导致菌株显著多样性和疾病多样性的细菌遗传因素值得被关注。全基因组测序是指对物种基因组序列进行测定，用来确定生物的遗传组成。Salvà-Serra等［5］对GAS进行全基因组测序，并对基因组组分进行分析，预测到噬菌体、CRISPR 系统、毒力基因及抗菌药物耐药基因，并对细菌重要基因、遗传变异、群体进化展开分析，进一步有效地为传染病诊断提供有价值的分类学和基因组学参考。本研究综合运用emm分型和基因组技术，对深圳市致猩红热GAS的基因型进行回顾性分析，明确主要流行型别，比较不同型别GAS基因变异性，阐明导致猩红热GAS的流行、进化规律，对深圳市猩红热病原学监测和防控具有一定意义。
1
资料与方法1.1 菌株 选择深圳市儿童医院生物样本库收集保存的176株GAS分离株，分离自2016年1月1 日至2018年5月31日在深圳市儿童医院门诊或住院的猩红热患儿（0~18岁）。对176株GAS分离株进行emm分型，选取具有代表性的18 株GAS分离株进行全基因组测序。本研究已通过深圳市儿童医院医学伦理委员会批准（批准文号：202104702），患儿监护人均知情同意，并签署知情同意书。18株GAS菌株选择标准：（1）来自不同年份emm1.0、emm12.0 主型 GAS 菌株各 5 株；（2）各年度emm1.0 和emm12.0 亚型各选1株，其中emm1.22、emm12.19型分别选取来自不同年份2株；（3）各年度菌株数相同，其中2016年、2017年、2018年各6株。本研究共选取导致深圳市儿童猩红热的emm1.0型（包括亚型）GAS 菌株 9株,emm12.0 型（包括亚型）GAS 菌株 9株。1.2 方法1.2.1 emm分型检测 通过PCR扩增及测序获得emm基因的5′端可变区序列并上传至分型数据库(https://www2.cdc.gov/vaccines/biotech/strepblast.asp)进行比对分析，确定emm型别。1.2.2 基因组序列测定 基因组测序由深圳华大基因公司使用lllumina Hiseq4000系统（美国lllumina公司）完成，测序后序列使用SOAPdenovo v1.05软件组装。1.2.3 比较基因组分析 （1）共有基因和特有基因：将所有待分析菌株的基因集进行聚类分析，将得到的基因集作为总基因集，提取聚类结果中每个样品都有的序列为核心基因集，特有的序列为特有基因集。（2）单核苷酸多态性（SNP）及插入或缺失（InDel）检测:SNP检测与注释基于组装结果和参考序列比对进行，首先对过滤后的序列进行组装，将组装结果与参考序列进行比对，进行SNP及基因组的某个位置上所发生的小片段序列的InDel。（3）基于SNP位点分析构建遗传进化树:按照相同顺序将所有SNP相连，获得相同长度的序列（其中一个为参考序列），作为输入文件，用TreeBeST软件的最大似然法算法构建系统进化树。1.3 统计学处理 采用SPSS 21.0 统计软件，符合正态分布的计量资料以x̄±s表示，非正态分布计量资料以M(Q1，Q3)表示，计数资料以百分比或率表示，率的比较采用χ2检验、校正χ2检验，非正态分布计量资料比较采用秩和检验，P<0.05 为差异有统计学意义。
2
结果2.1 引起儿童猩红热GAS 的emm分型分析 176株GAS 分离株中，emm12.0 及其亚型(108/176株，61.4%)检出最高，其次为emm1.0 及其亚型(53/176株，30.1%)。结果见表1。
3
讨论研究表明，多克隆emm12.0和emm1.0型别是2011年中国流行性猩红热相关GAS 菌株的主要emm型别［6］。2014年英国猩红热疫情的流行病学监测显示，区域性暴发是由多种（emm3.0、emm12.0、emm1.0和emm4.0）基因类型及系统发育谱系引起的，单基因ssa与猩红热患病率显著增加相关［7］。本研究为回顾性研究，分析了2016年至2018年深圳市儿童医院生物样本库收集保存的176株猩红热患儿来源的GAS分离株，emm分型结果显示，深圳地区致猩红热患儿GAS的型别主要为emm12.0型及emm1.0型，这与之前国内报道［8］的流行型别相符。另有一些研究发现［9］，近10年来，emm1.0型的比例有上升趋势，emm12.0型则有下降趋势。但总体来讲，emm12.0型和emm1.0型GAS菌株依然是导致深圳地区儿童猩红热的主要菌株，这为深圳地区猩红热病原学监测和防控提供了参考意义，也为未来疫苗研究提供依据。本研究对代表性菌株进行全基因组测序发现，猩红热儿童来源的emm1.0和emm12.0型GAS菌株大小为 1.82~1.93 Mb，GC含量为39.03%~39.15%，与参考序列GCA-900984775相似。对不同型别菌株基因组组成之间进行全基因组序列比较发现，不同型别之间存在遗传变异，其中emm12.0 型GAS菌株SNP及InDel数均多于emm1.0 型GAS菌株，说明其存在较高的遗传多样性。基因组变异、重组、移动元件横向转移可能是导致GAS菌株遗传多态性的内在动力［10］。一些研究认为，emm12.0型GAS引起猩红热的能力在流行病学上与新的噬菌体的存在有关，包括编码分泌的超抗原SSA和SpeC的噬菌体ΦHKU.vir和DNaseSpd1［11］。噬菌体在GAS种群形成、遗传转移和毒力中起关键作用，可通过消除易感血清型来改变种群分布，也可通过转导作为毒力基因和抗生素耐药性遗传转移的关键介质［12］。GAS前噬细胞已被证明是该病原体毒力的主要促成因素［13］，且噬菌体具有携带毒力基因、全基因组调控等作用。本研究未进一步对毒力基因及噬菌体等遗传元件进行分析，本课题组另一项研究［14］对中国儿童emm1.0和emm12.0菌株进行全基因组测序和系统发育分析发现，这些菌株对大环内酯类抗生素和四环素的耐药率和耐药水平很高，主要表达ermB和tetM，vanuG和毒力基因的分布与emm类型有关。先前报道的重要噬菌体，如φHKU16.vir、φHKU488.vir、Φ5005.1、Φ5005.2和Φ5005.3编码链球菌毒素以及整合性结合元件（integrative conjugative elements，ICEs），如ICE-emm12和ICE-HKU397编码大环内酯类和四环素耐药基因，在深圳的emm1.0或emm12.0克隆群中存在。本研究测序的基因组数据为中国GAS分子监测提供重要参考，但未进一步对SNP对应的毒力基因、耐药基因及噬菌体作进一步分析，未来需继续关注以明确菌株遗传多样性对于疾病分布及转归的影响。全基因组测序技术对于发病率增加的疾病，从病原菌遗传进化的角度作出了很好解释［15］，也增进了对新遗传元件的出现和与疾病相关的基因表达的相互作用的认识。随着国际上GAS基因组序列数据库的扩展，除了为GAS种群基因组学提供新的见解外，还能够生成一个比较基因组学的迭代框架［16］，全基因组测序仍然是绘制新兴GAS菌株图谱的重要工具。但仍需进一步的研究来描述GAS毒力基因的致病机制，并揭示监测和治疗这些疾病的新策略。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
点击“阅读原文”免费下载PDF全文