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作者：童晓1 龚芳2 管超姣3 蒋昱岑4 张冰洁1 周雪梅1 季拓2 申卫红2通信作者：龚芳，Email：gongfang2004@163.com作者单位：1江南大学附属医院检验科，无锡 214000；3湖州市第一人民医院儿科，湖州 313000；4江南大学医学院，无锡 214122本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(23):1793-1796.引用本文：童晓,龚芳,管超姣,等.外周血滤泡调节性T细胞/滤泡辅助性T细胞及相关细胞因子在尘螨变应性哮喘患儿中的变化及意义[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(23):1793-1796.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20220705-00823.
摘要
目的 探讨尘螨变应性哮喘患儿外周血滤泡调节性T（TFR）细胞/滤泡辅助性T（TFH）细胞及相关细胞因子变化，并探讨其临床意义。方法 回顾性研究。选取2021年1月至12月江南大学附属医院25例急性发作期尘螨变应性哮喘患儿（哮喘组）和同期16例性别和年龄相匹配的健康体检儿童（健康对照组）作为研究对象。采用流式细胞法检测2组外周血TFR细胞、TFH细胞比例；流式细胞微球芯片捕获法检测2组细胞因子［白细胞介素（IL）-10、IL-21］水平；荧光酶免疫技术检测2组尘螨特异性IgE（sIgE）水平；血细胞分析仪检测外周血嗜酸性粒细胞比例。采用t检验进行组间分析，指标间相关性采用Spearman秩相关分析。结果 哮喘组TFR细胞/TFH细胞免疫失衡。与健康对照组比较，哮喘组TFR细胞比例较低［（0.11±0.03）% 比（0.13±0.03）%］，TFH细胞比例较高［（5.07±1.75）% 比（3.80±1.60）%］，TFR细胞/TFH细胞比值较低（0.02±0.01比0.05±0.03），差异均有统计学意义（t=2.29、2.30、3.71，均 P<0.05）。与健康对照组比较，哮喘组IL-21水平较高［（547.85±195.13） ng/L比（404.94±110.41） ng/L］,IL-10水平较低［（10.18±3.49） ng/L比（14.79±5.65） ng/L］，差异均有统计学意义（t=2.60、3.15，均 P<0.05）。哮喘组TFR细胞/TFH细胞比值与sIgE呈负相关（r=－0.444 2,P=0.026 1），与嗜酸性粒细胞百分比无相关性（r=－0.135 2,P=0.519 3）。结论 尘螨变应性哮喘患儿存在TFR细胞/TFH细胞亚群失衡，失衡的TFR细胞、TFH细胞及其相关细胞因子IL-10、IL-21可能参与调控哮喘sIgE的生成。
关键词
滤泡调节性T细胞；滤泡辅助性T细胞；尘螨变应性哮喘；白细胞介素-10；白细胞介素-21
变应性哮喘是一类由花粉、动物皮屑、尘螨等变应原引发的以免疫球蛋白E（IgE）水平升高为主要特征的变应性疾病，是儿童期最常见的呼吸道慢性疾病［1］。2010年全国0~14岁城区儿童哮喘流行病学调查显示，城区0~14岁哮喘总患病率为3.02%，是20年前的3.3倍；最近10年上升约50%,增速远高于发达国家平均水平［2］。流行病学调查表明，广东地区呼吸道变应性疾病患儿对尘螨致敏阳性率最高，达80%以上［3］。因此，探究尘螨变应性哮喘的发病机制可为后续寻找更有效的治疗手段提供帮助。既往认为Th1/Th2免疫应答失衡是经典的支气管哮喘发病机制。近年来发现滤泡调节性T（TFR）细胞和滤泡辅助性Ｔ（TFH）细胞是负、正向调控生发中心体液免疫反应的最主要细胞亚群，且这2种细胞也参与变应性疾病，特别是变应性鼻炎的病理机制［4］。因此，本研究观察尘螨变应性哮喘患儿外周血中TFR细胞/TFH细胞及相关细胞因子变化，并探讨其临床意义，以期为临床进一步研究提供参考。
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资料与方法1.1 研究对象 回顾性研究。选择2021年１月至12月江南大学附属医院25例急性发作期尘螨变应性哮喘患儿为哮喘组，其中男19例，女6例；年龄（4.31±1.90）岁。哮喘诊断标准参照全球哮喘防治创议（GINA）［5］和中华医学会儿科学分会呼吸学组制定的《儿童支气管哮喘规范化诊治建议（2020年版）》［6］，且尘螨特异性IgE（sIgE）结果为阳性。患儿在入选前1个月内均未应用口服或吸入糖皮质激素或其他免疫抑制剂，1个月内无其他儿童常见的急性感染，如急性咽/扁桃体炎、急性鼻窦炎、急性喉炎、急性支气管炎等。选择同期儿童保健门诊体检健康的16例儿童为健康对照组，其中男8例，女8例；年龄（4.73±2.29）岁；尘螨sIgE结果为阴性，且无过敏性疾病史和其他慢性疾病。本研究通过江南大学附属医院医学伦理委员会批准（批准文号：LS2020046），标本采集均获得患儿监护人知情同意。1.2 方法 乙二胺四乙酸二钾采集管采集抗凝血4 mL，离心收集血浆，离心条件：450 g，5 min，4 ℃，离心半径16 cm。流式细胞微球芯片捕获技术法检测细胞因子［白细胞介素（IL）-10、IL-21］水平；荧光酶免疫技术检测sIgE水平；采用流式荧光法在全光谱流式细胞仪上检测外周血TFH细胞、TFR细胞在单个核细胞中比例；血细胞分析仪检测外周血嗜酸性粒细胞比例。为降低批次操作间差异影响，收集到的所有外周血单个核细胞标本先液氮冻存，同批复苏进行流式检测；所有血浆标本置－80 ℃冻存，同批操作检测细胞因子及sIgE水平。1.3 仪器与试剂 仪器：CytekTMNL-CLC全光谱流式细胞仪（Cytek Biosciences，美国），全自动血液细胞分析仪BC-5000（迈瑞，中国），Phadia ImmunoCAP（Thermo Fisher Scientific，美国）。试剂：Ficoll-Hypaque （Axis-Shield，挪威）、［CD3-AF532、CD19-SB436、7-AAD（eBioscience，美国）］、［TCRγδ-BV480、CD4-BV750、CD127-APC-R700（BD，美国）］、［CD8a-BV570、CD25-PE、CXCR5-APC、CD45RA-AF488（Biolegend，美国）］、Bio-AimPlexTM Human T Helper Cytokine 16-Plex（北京旷博，中国）。1.4 统计学处理 采用SPSS 23.0统计学软件进行统计学分析。计量资料以x̄±s表示，经正态性检验后正态分布的数据比较采用t检验，指标间相关性采用Spearman秩相关分析。使用GraphPad Prism 8软件进行数据作图，P<0.05为差异有统计学意义。
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结果2.1 临床资料 哮喘组患儿发病年龄为（2.57±1.22）岁；有喘息、咳嗽及呼吸困难症状者分别为19例（76%）、22例（88%）、5例（20%）；有过敏性鼻炎、过敏性皮炎、食物过敏及过敏性疾病家族史者分别为10例（40%）、13例（52%）、9例（36%）、11 例（44%）；15 例（60%）规律治疗，10例（40%）间断治疗；18 例（72%）控制较好，7 例（28%）部分控制。2组尘螨sIgE 水平与嗜酸性粒细胞水平比较，差异均有统计学意义（均 P<0.05）（表1）。
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讨论儿童哮喘具有高度异质性，不同表型或年龄的儿童在疾病进展、治疗反应等方面都存在显著差异。以往多数研究通常集中在6岁及6岁以上的学龄期儿童，相较于学龄期的哮喘患儿，6岁以下学龄前期的儿童哮喘患病率并不低，前者发病率约为6.4%，后者为4.4%［7］，因此6岁以下患儿也是哮喘儿童中不可忽略的群体。本研究对6岁以下哮喘患儿展开研究。CD4+T细胞是哮喘IgE调控研究领域的热点，Th1/Th2失衡，且向Th2偏移是经典的哮喘免疫学致病机制［1］。近年来，新细胞亚群不断被发现，也为哮喘病理机制研究提供了新的研究方向。TFR细胞是近年来发现的参与负向调控生发中心体液免疫反应的最主要细胞群体。该细胞同时具有TFH细胞及调节性T细胞的双重表达特征［8］：不仅表达TFH细胞迁移并维持在生发中心所需的特征表面分子［如CXCR5、程序性死亡受体1、可诱导共刺激分子（ICOS）］，同时还表达调节性T细胞发挥抑制功能相关分子，如糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体和细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）等。CTLA-4通过和B淋巴细胞表面CD80或CD86配体结合后传递负向信号，抑制B淋巴细胞活化；TFR细胞上CTLA-4表达缺失会导致其免疫抑制功能明显减弱，生发中心B淋巴细胞抗体反应自发增强［9］。TFR细胞还可通过分泌IL-10调控B淋巴细胞［10］。此外，TFR细胞可分泌穿孔素依赖的粒酶B，以直接杀伤B淋巴细胞的作用方式抑制生发中心中抗体反应［8］。相对于TFR细胞是负向促进生发中心体液免疫，TFH细胞则是生发中心辅助B淋巴细胞发挥免疫效应的最主要T淋巴细胞群体，TFH细胞通过分泌细胞因子IL-21及表达ICOS、白细胞分化抗原40配体等作用于B淋巴细胞，促进B淋巴细胞发生增殖活化、体细胞高频突变、免疫球蛋白类别转换等一系列重要功能变化［11］。TFR细胞、TFH细胞数量和功能正常是有效免疫应答的保证，维持了生发中心抗体生成的免疫平衡。但由于感染或某些原因致TFR细胞数量下降、负向调控B淋巴细胞能力不足，或TFH细胞过度扩增、对B淋巴细胞产生过强的辅助信号，机体便会出现抗体积聚相关疾病［12］。TFR细胞/TFH细胞失衡被发现参与类风湿性关节炎［12］、系统性红斑狼疮［13］等多种自身免疫性疾病的IgG、IgM或IgA异常积聚过程。国内华中科技大学同济医学院刘争教授团队率先在过敏性鼻炎中发现，过敏性鼻炎患者生发中心和外周血TFR细胞数量均显著降低，且患者来源的TFR细胞体外抑制B淋巴细胞IgE生成的能力显著降低；但过敏性鼻炎患者TFR细胞抑制B淋巴细胞分泌IgG、IgM、IgA能力则不受影响；值得关注的是，过敏原特异免疫治疗12个月后，伴随TFR细胞/TFH细胞平衡得到恢复，患者临床症状缓解［4］。本课题组前期研究发现，成人哮喘外周血中TFH细胞增多且异常活化，TFH细胞通过分泌细胞因子IL-21、IL-4 促进B淋巴细胞分泌IgE水平异常增高［14-16］。本研究中，在6岁以下尘螨变应性哮喘患儿中也发现外周血TFH细胞增多的现象，另外还发现该类哮喘患儿外周血TFR细胞减少、TFR细胞/TFH细胞比值显著下降。为验证上述现象，进一步对哮喘患儿血浆中细胞因子的表达进行分析发现，其与TFR细胞、TFH细胞比例变化一致，哮喘组TFR细胞特征细胞因子IL-10水平较健康对照组下降，而TFH细胞特征细胞因子IL-21水平则高于健康对照组。通过相关性分析发现，TFR/TFH比值与哮喘患儿sIgE水平呈显著负相关。综上，本研究发现，尘螨变应性哮喘患儿TFR细胞/TFH细胞失衡，失衡的TFR细胞、TFH细胞及其相关细胞因子IL-10、IL-21可能共同参与了调控哮喘sIgE的生成过程，为探索哮喘更有效的治疗手段提供了新的突破口。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
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