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作者：吴鼎文 杨茹莱 刘晨 童凡 陈帅 赵正言通信作者：赵正言，Email:zhaozy@zju.edu.cn作者单位：浙江大学医学院附属儿童医院遗传与代谢科，国家儿童健康与疾病临床医学研究中心，浙江省新生儿疾病诊治重点实验室，杭州 310052本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2023,38(1):49-53.引用本文：吴鼎文,杨茹莱,刘晨,等.异戊酰基肉碱代谢异常新生儿的遗传学分析[J].中华实用儿科临床杂志,2023,38(1):49-53.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20221102-01248.
摘要
目的 探讨新生儿异戊酰基肉碱（C5）代谢异常的遗传学原因。方法 回顾性研究。以2018年1月至2021年12月在浙江大学医学院附属儿童医院经串联质谱法筛查为C5增高的34例新生儿为研究对象，收集其筛查与临床随访资料。采集乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝静脉血，提取基因组DNA，采用液相捕获技术靶向捕获ACADSB、IVD、ACADM等79个遗传代谢病相关基因，通过高通量测序和生物信息学分析获取基因的变异信息，参考美国医学遗传学与基因组学学会分类标准进行分级。依据基因检测情况，将C5增高新生儿分为未检出变异组（11例）、ACADSB变异组（16例）、IVD变异组（7例），采用威尔科克森秩和检验分析组间差异。结果 34例新生儿中16例检出ACADSB变异，涉及6种变异型，其中c.461G>A(p.G154E)、c.746delC(p.P249Lfs*15)为新发现的变异型；7例检出IVD变异，涉及11种变异型，其中c.118A>G(p.N40D)、c.296-10C>G、c.302A>G(p.Y101C)、c.537G>A(p.M179I)、c.667C>T(p.R223W)、c.983A>G(p.K328R)、c.1147+5G>A为新发现的变异型。3个组别新生儿的C5初筛浓度值比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 该地区新生儿筛查出现C5增高的主要遗传学原因为ACADSB与IVD基因变异。对于新发现的基因变异型，建议联合多种生物信息学分析软件进行功能预测，且后续的临床随访与评估仍然重要。
关键词
异戊酰基肉碱；遗传学测试；基因变异；新生儿筛查
采用串联质谱技术（tandem mass spectrometry，MS/MS）进行氨基酸及酰基肉碱谱分析用于多种遗传代谢病的新生儿筛查具备良好的成本效益，已在国际上广泛开展［1-3］。虽然MS/MS具有较高的灵敏度和特异度，但筛查病种的扩充可能出现更多的假阳性，从而降低筛查效率［4］。异戊酰基肉碱（isovaleryl carnitine,C5）是MS/MS检测的重要指标之一，主要用于异戊酸血症(isovaleric acidemia，IVA)的新生儿筛查［5］。因C5与2-甲基丁酰肉碱呈现相同的质荷比，MS/MS检测不能区分，故进一步的分型检测十分关键［6］。基因检测是对生化检测的有效补充，提高了遗传代谢病诊断的准确性，具有重要的临床应用价值［7］。基于靶向基因捕获的高通量测序是针对感兴趣的特定基因外显子区域定制探针，与基因组DNA进行杂交，经富集后利用高通量测序技术进行测序分析。因为测序的目标区域只占基因组的一小部分，所以可在保证获得足量目标基因变异信息的前提下，极大地降低测序成本。靶向基因捕获与高通量测序的组合应用既保留了信息自动化分析的优势，又避免检测过多冗余内含子区域，从而大大提高了基因缺陷疾病的检测效率［8-9］。因此，本研究通过分析C5代谢异常新生儿的基因变异，了解基因变异型与生化表型的关系，以期为临床管理和决策提供科学依据。
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资料与方法1.1 研究对象 回顾性研究。收集2018年1月至2021年12月在浙江大学医学院附属儿童医院经MS/MS筛查结果为C5增高的34例新生儿筛查与临床随访资料。其中男15例，女19例；孕周（37.82±2.49）周；出生体重（3 154.00±617.14） g。在知情同意原则下由法定监护人签署知情同意书，采集C5增高新生儿及其父、母亲乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝静脉血各1.0 mL，4 ℃保存备用。本研究获得浙江大学医学院附属儿童医院医学伦理委员会批准（批准文号：2018-IRB-076）。1.2 主要仪器及试剂 Xevo TQD串联质谱系统（美国Waters公司）；Nanodrop2000超微量核酸蛋白测定仪(Thermo Fisher Scientific公司)；HiSeq 2500高通量测序平台(Illumina公司)；3500XL测序仪（ABI Life 公司）；NeoBase Non-derivatized MSMS Kit（Perkin Elmer公司）；QIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen公司）；Qubit dsDNA Kit（Invitrogen公司）；Agencourt AMPure XP磁珠(Beckman Coulter公司)；TruePrepTM DNA Library Prep Kit V2 for Illumina® Kit(Vazyme公司)；TruePrepTM Index Kit V2 for Illumina® Kit(Vazyme公司)；High Sensitivity DNA Kit（Agilent公司）；DNA Quantification Stan-dards and Primer Premix Kit (Kapa Biosystems公司)；LA PCRTM Kit（TaKaRa公司）；Nucleo Spin® Gel and PCR Clean-up（Macherey-Nagel公司）；BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（ Invitrogen公司）。1.3 C5检测 依据新生儿疾病筛查技术规范的要求采集干滤纸血片，参考NeoBase Non-derivatized MSMS Kit说明书进行实验操作，于Xevo TQD串联质谱系统进行检测。C5检测值参考范围为0.01~0.40 μmol/L。召回MS/MS初筛发现C5指标增高的新生儿，重新采样进行MS/MS检测，C5仍增高者确定为“C5增高”。1.4 基因变异检测 1.4.1 DNA提取 采用QIAamp DNA Blood Mini Kit，按照说明书提取全血基因组DNA，采用紫外分光光度计与Invitrogen Qubit dsDNA试剂盒检测DNA浓度和纯度。1.4.2 建库及测序 安捷伦公司定制ACADSB、IVD、ACADM等79个遗传代谢病相关基因的捕获探针，通过多重探针杂交方法靶向富集目标区域序列；Agencourt AMPure XP磁珠纯化捕获产物。按照TruePrepTM DNA Library Prep Kit V2 for Illumina® Kit操作说明书处理纯化产物，建库过程中每个样本都会加上特殊标签index。文库经Qubit及2100 Bioanalyzer进行浓度及片段大小质检分析确定合格后，利用DNA Quantification Standards and Primer Premix Kit进行文库精确定量并确定上机样本量，最后在HiSeq 2500平台进行测序反应。测序数据总量>500 M，目标区覆盖度>99.90%，目标区平均测序深度>300次。1.4.3 数据处理 将高通量基因靶向测序数据Fastq进行低质量过滤，以人类基因组hg19为参考序列，通过BWM、Picard等生物信息软件进行序列比对与重复标记。采用GATK、Samtools进行变异位点的识别［10］。采用Annovar注释软件将变异位点注释到公共突变数据库，以变异位点的人群频率、序列保守性、变异所处的位置等条件进行筛选。1.5 基因变异的遗传来源检测 采用Sanger测序法对新生儿及其父、母亲进行候选变异位点的验证检测，以明确变异的遗传来源及顺式或反式。取20 ng DNA，使用待测位点的特异性引物，按照LA PCRTM Kit 操作流程进行PCR反应，并使用NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up纯化PCR产物。回收PCR产物按照BigDye® Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit操作流程进行测序PCR反应及纯化。纯化产物于ABI 3500XL平台进行测序。测序结果采用SeqMan软件进行序列比对分析。1.6 基因变异的遗传学分析与病例分组 通过检索NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获得ACADSB基因（NM_001609.4）和IVD基因（NM_002225.5）的蛋白质序列。通过SMART数据库（http://smart.embl-heidelberg.de/smart/change_mode.pl）对基因的蛋白质序列进行功能域预测。并采用REVEL、ClinPred和MVP等生物信息软件预测错义变异的危害性，使用SpliceAI软件预测变异是否影响基因剪切。检索ClinVar、HGMD、LOVD变异数据库对检出变异的收录与注释情况，检索PubMed数据库对检出变异的文献报道情况。参考美国医学遗传学与基因组学学会分类标准结合临床随访情况对上述方法检出的候选变异型进行致病性评估，具体分为“致病的、可能致病的、意义未明的、可能良性的、良性的”5级［11］。评估为“致病的、可能致病的、意义未明的”的基因变异纳入本次研究。依据基因检测情况，将C5增高新生儿分为未检出变异组、ACADSB变异组、IVD变异组。1.7 统计学处理 通过R语言（https://www.r-project.org/）编程，采用威尔科克森秩和检验统计方法进行数据分析。数据以x̄±s表示，P<0.05为差异有统计学意义。
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结果2.1 蛋白功能域与基因变异情况 预测结果显示，ACADSB基因包含3个功能域，分别为Acyl-CoA_dh_N (58-170位氨基酸 )、Acyl-CoA_dh_M (173-268位氨基酸)和Acyl-CoA_dh_1 (280-428位氨基酸)。IVD基因包含3个功能域，分别为Acyl-CoA_dh_N (43-157位氨基酸)、Acyl-CoA_dh_M (160-258位氨基酸)和Acyl-CoA_dh_1 (270-418位氨基酸)。34例新生儿中，16例检出ACADSB变异，涉及6种变异型（4种错义、1种无义、1种移码），其中c.1165A>G（p.M389V）为最常见的变异型（占16/32），c.461G>A(p.G154E)和c.746delC(p.P249Lfs*15)为新发现的变异型。7例检出IVD变异，涉及11种变异型，其中c.118A>G(p.N40D）、c.296-10C>G、c.302A>G(p.Y101C)、c.537G>A(p.M179I)、c.667C>T(p.R223W)、c.983A>G(p.K328R)、c.1147+5G>A为新发现的变异型。本次检出ACADSB和IVD的错义变异均位于蛋白的重要功能域，REVEL预测其中10种为有害变异，ClinPred预测其中12种为有害变异，MVP预测其中11种为有害变异。11例未检出C5代谢障碍相关基因变异。提示ACADSB、IVD基因变异是导致新生儿血C5增高的主要遗传学原因。C5增高新生儿的基因变异检出情况见表1。
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讨论新生儿遗传代谢病筛查作为提高出生人口素质、防治出生缺陷的重要手段，已成为出生缺陷三级预防体系的核心。采用MS/MS用于新生儿遗传代谢病筛查领域具有里程碑意义［12-13］。C5是MS/MS新生儿筛查的重要指标，通常用于IVA的筛查。短/支链特异性酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(short/branched chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency,SBCADD)是由于L-异亮氨酸代谢途径错误引起的常染色体隐性遗传疾病，表现为2-甲基丁酰基肉碱异常增高。鉴于2-甲基丁酰基肉碱与C5的质和比相同，基于MS/MS的新生儿筛查可将IVA与SBCADD同步筛出，因此后续的鉴别诊断十分重要。IVA是由IVD基因突变引起的，呈常染色体隐性遗传，其临床表型呈多样性。有学者建议将IVA患者依据生化表型分类为“代谢严重型”和“代谢轻度或中等型”进行分层管理［14］。对于“代谢轻度或中等型”，建议密切临床随访，必要时补充肉碱；对于“代谢严重型”，建议密切临床随访，饮食控制并“肉碱和甘氨酸的联合治疗”［14］。基因型与表型的相关性研究表明，IVD基因变异型和表型没有很好的相关性，但发现IVD基因932C>T (A282V)变异型仅表现为“轻微的IVA表型”，且是最常见的变异型（占47%）［15］。而本次研究并未检出该变异，所检出IVD基因的11种变异型离散分布，且其中7种为新发现的变异型，提示IVD基因的变异具备明显的种族差异，在中国人群中没有明确的热点变异型。本次检出4例IVD单等位基因变异，在临床随访中C5值表现为“回归正常或持续下降”，提示IVD单等位基因变异携带者可出现“阶段性C5增高”。3例检出IVD双等位基因变异，其中2例携带2个变异位点的患儿表现为“代谢轻度或中等型”，1例携带3个变异位点的患儿表现为“代谢严重型”，提示IVD基因复杂变异的表型更严重。SBCADD是由于ACADSB基因中的纯合或复合杂合突变所致，通常在临床上无症状，但约10%的报告中患者可出现发育迟缓和神经系统体征［16］。本次检出16例C5增高新生儿携带ACADSB基因的变异，涉及6种基因型，其中c.1165A>G（p.M389V）为最常见的变异型（占50%），提示该变异为中国人群的“奠基者”变异型。15例为ACADSB双等位基因变异，临床随访中C5值表现为“中低水平波动或回归正常”，且在正常喂养情况下生长发育正常，支持SBCADD主要表现为良性疾病。对于无症状患者，有学者建议进行纵向随访并提供管理急性分解代谢事件的应急预案，以预防急性代谢失代偿［16］。本次检出IVD基因的9种错义变异型和ACADSB基因的4种错义变异型均位于蛋白的重要功能域。REVEL、ClinPred与MVP是当前预测错义变异危害性的主流生物信息软件，均具备强大的性能，但各具优势［17-19］。经预测，REVEL成功预测10种变异型并提示为致病性的，其结果与ClinPred的预测结果一致，而其中1个位点MVP的预测存在差异，提示REVEL预测的准确性高，但敏感性欠佳。ClinPred与MVP均能有效预测本次检出的所有错义变异型，但有3个差异性位点，其中1个为已知致病性变异，ClinPred预测为“有害的”，而MVP预测为“容忍的”，提示ClinPred与MVP预测的敏感性高，其中MVP预测的准确性略低。因此建议采用多个生物信息软件联合对错义变异进行危害性预测。据报道，新生儿或母亲使用含新戊酸的抗生素或含新戊酸衍生物的润肤剂是导致“C5假阳性”的主要原因［20-21］。本次研究中有11例C5增高新生儿未检出基因变异，是否使用含新戊酸的抗生素或含新戊酸衍生物的润肤剂有待进一步调查。综上所述，靶向捕获疾病基因联合高通量测序能高效探查C5代谢异常儿的遗传学背景，可推荐为MS/MS筛查阳性儿临床鉴别及分型诊断的首选方法。本研究结果显示ACADSB与IVD基因变异是导致新生儿筛查出现C5增高的主要遗传学原因，并拓展了ACADSB、IVD的变异类型。对于新发现的基因变异型，其致病性评估具备挑战，建议联合多种生物信息学分析软件进行功能预测，必要情况下进行功能验证，且后续的临床随访与进一步评估仍然重要。
参考文献略
本文编辑：申玉美
数字编辑：郑成铭
制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部
《中华实用儿科临床杂志》
面向临床
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