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作者：王潇娜1 梅道启2 罗淑颖1 高超3 张耀东1通信作者：张耀东，Email：syek@163.com作者单位：1郑州大学附属儿童医院，河南省儿童医院郑州儿童医院，河南省儿童遗传代谢性疾病重点实验室，河南省儿童神经发育工程研究中心，郑州 450053;2郑州大学附属儿童医院神经内科，郑州 450018;3郑州大学附属儿童医院康复科，郑州 450053本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2023,38(2):140-145.引用本文：王潇娜,梅道启,罗淑颖,等.ICG-001对大鼠孤独症样行为及海马树突棘形态发育的影响[J].中华实用儿科临床杂志,2023,38(2):140-145.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20220119-00072.
摘要
目的 探讨ICG-001对大鼠孤独症样行为及海马锥体神经元树突棘形态发育的影响。方法 健康雌性Wistar大鼠自然受孕，出生子代大鼠依据随机数字表法分为4组：生理盐水对照组、ICG-001对照组、丙戊酸钠（VPA）组和ICG-001处理组。每组12只。运用三箱社交、埋珠、旷场和高架十字迷宫实验检测大鼠社交、重复刻板和焦虑样行为。应用免疫荧光检测大鼠海马CA1区神经特异核蛋白（NeuN）阳性神经元数目。高尔基染色法观察大鼠海马锥体神经元树突棘密度和形态改变。Western blot检测大鼠海马磷酸化LIM激酶1（LIMK1）、肌动蛋白结合蛋白（Cofilin）、纤维状肌动蛋白（F-actin）和脑发育调节蛋白A（Drebrin A）蛋白表达。采用单因素方差分析统计学差异，以Tukey法进行组间比较。结果 1.三箱社交行为实验：生理盐水对照组、ICG-001对照组、VPA组和ICG-001处理组与新奇大鼠接触时间分别为（219.42±5.38） s、（218.67±10.12） s、（126.58±5.02） s、（218.58±6.63） s， 偏好指数分别为0.43±0.05、0.43±0.04、0.22±0.01、0.42±0.04；与VPA组相比， ICG-001处理组接触时间及偏好指数均显著增加（均 P<0.05）。2.埋珠实验：4组大鼠埋珠数量分别为（9.13±0.52）个、（9.08±0.64）个、（15.13±0.82）个、（9.42±0.86）个；与VPA组相比，ICG-001处理组埋珠数量显著减少（P<0.05）。3.旷场实验：4组大鼠的中央区域停留时间分别为（82.33±1.83） s、（81.32±4.19） s、（45.51±3.02） s、（81.44±3.19） s；与VPA组相比，ICG-001处理组中央区域停留时间明显增加（P<0.05）。4.高架十字迷宫实验：4组大鼠在开臂停留时间分别为（107.75±7.23） s、（106.08±7.50） s、（63.42±1.91） s、（106.67±7.07） s；与VPA组相比，ICG-001处理组在开臂停留时间显著增加（P<0.05）。5.免疫荧光实验：4组大鼠海马CA1区NeuN阳性神经元数量分别为（41.83±1.17）×104/μm2、（41.00±0.77）×104/μm2、（27.17±0.95）×104/μm2、（40.00±0.90）×104/μm2；与VPA组相比，ICG-001处理组NeuN阳性神经元数量明显较多（P<0.05）。6.高尔基染色实验：4组大鼠海马CA1区锥体细胞树突棘密度分别为（0.74±0.04）个/μm、（0.73±0.03）个/μm、（0.49±0.03）个/μm、（0.70±0.02）个/μm，其中蘑菇型顶树突棘所占百分比（0.49±0.02）%、（0.49±0.02）%、（0.33±0.02）%、（0.43±0.02）%，瘦长型顶树突棘所占百分比（0.27±0.02）%、（0.26±0.02）%、（0.34±0.01）%、（0.26±0.01）%。与VPA组相比，ICG-001处理组海马CA1区锥体细胞顶树突棘密度明显增加（P<0.05），蘑菇型树突棘增多和瘦长型顶树突棘减少（均P<0.05）。7.Western blot实验：4组大鼠海马磷酸化LIMK1/LIMK1比值分别为100.33±2.30、99.34±2.28、57.76±4.10、99.13±1.90，磷酸化Cofilin/Cofilin比值分别为100.18±2.43、100.18±1.70、57.12±1.88、99.53±1.69，F-actin/球状肌动蛋白（G-actin）比值分别为100.07±0.86、99.99±1.72、51.19±1.23、99.28±3.17，Drebrin A蛋白相对表达量分别为100.79±1.19、100.12±2.04、52.86±3.26、99.97±2.44；与VPA组相比，ICG-001处理组显著上调了海马中磷酸化LIMK1、Cofilin、F-actin和Drebrin A表达（均P<0.05）。结论 ICG-001可能通过调控LIMK1/Cofilin信号通路，促进F-actin形成和上调Drebrin A 表达，增强树突棘形态发育，进而改善大鼠孤独症样行为。
关键词
孤独症；ICG-001；树突棘；LIM激酶1/肌动蛋白解聚因子通路；脑发育调节蛋白A
孤独症是一种神经发育障碍性疾病，临床特征包括社会交往障碍和重复刻板行为，伴焦虑及认知功能降低，给社会、家庭造成巨大的经济和精神负担。2018年，美国儿童孤独症患病率为1/59［1］，中国6~12岁儿童孤独症患病率约为0.7%，呈逐年上升趋势［2］。本病发病机制尚未阐明，仍缺乏有效的治疗手段。研究表明，树突棘密度和形态异常与孤独症症状密切相关［3-4］。LIM激酶1（LIM kinase 1，LIMK1）是肌动蛋白结合蛋白（Cofilin）的磷酸化酶。LIMK1/Cofilin信号通路调控纤维状肌动蛋白（F-actin）形成，参与树突棘形成［5］，该通路紊乱是引起孤独症重要的发病机制［6］。此外，脑发育调节蛋白A（Drebrin A ）介导树突棘形态发育。Drebrin A 通过抑制Cofilin对F-actin剪切作用，稳定F-actin结构，促进树突棘形成［7］。β-连环蛋白（β-catenin）是孤独症的风险基因［8］。ICG-001是小分子化合物，可抑制细胞核中β-catenin与C末端结合蛋白（CBP）的相互作用。本研究通过丙戊酸钠（Sodium valproate，VPA）建立大鼠孤独症模型，探讨ICG-001对大鼠孤独症样行为、海马树突棘发育及磷酸化LIMK1和Cofilin、F-actin和Drebrin A蛋白表达的影响。
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材料与方法1.1 实验动物 8周龄雄性和雌性Wistar大鼠，清洁级，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供［动物许可证：SCXK（鲁）2019-0003］，共48只。每笼3只，室温22~25 ℃，相对湿度55%~65%，自由饮水进食，光照/黑暗周期为12 h/12 h。1.2 试剂和仪器 Golgi染色试剂盒购于美国FD NeuroTechnologies 公司。兔抗p-LIMK1和 LIMK1抗体购于美国Sigma公司。兔抗p-Cofilin和Cofilin抗体购于美国Cell Signaling Technology公司。小鼠抗F-actin、G-actin和兔抗Drebrin A抗体购于美国Abcam 公司。三箱社交、旷场和高架十字迷宫购于上海欣软信息科技有限公司。ANYmaze分析软件购于美国Stoelting公司。1.3 动物分组 参照本实验室构建孤独症大鼠模型的方法［9］。大鼠雌雄比例1∶1配种。孕鼠按照随机数字表法分为2组，一组孕12.5 d腹腔注射600 mg/kg VPA，另一组孕鼠腹腔注射等量生理盐水。仔鼠出生第7天，注射VPA的雄性大鼠分为VPA组和ICG-001处理组。注射生理盐水的大鼠依据数字表法随机分为生理盐水对照组和ICG-001对照组。生理盐水对照组和VPA组大鼠腹腔注射生理盐水（5 mg/kg），ICG-001对照组和ICG-001处理组大鼠分别腹腔注射5 mg/kg ICG-001［10］，1次/d，共21 d。大鼠脑内ICG-001水平为2.25 mg/L。每组12只。大鼠出生第43-46天，进行三箱社交、埋珠、旷场和高架十字迷宫实验。行为学实验结束后，每组大鼠各取6只分别进行免疫荧光、高尔基染色和Western blot实验。1.4 行为学检测 1.4.1 三箱社交实验 三箱社交实验检测大鼠社交行为及其对新鲜事物的偏好程度。参照本实验室建立的实验方法［11］，透明塑料箱（60 cm×40 cm×22 cm）分为左、中、右3个部分。将一只陌生大鼠置于箱子一侧，另一侧放置空网笼，实验鼠放入中间箱子，记录10 min大鼠进入装有新奇大鼠的腔室和空网笼的腔室，运用［与新奇大鼠接触时间-与空网笼接触时间］/［与新奇大鼠接触时间+与空网笼接触时间］比值作为偏好指数评价其社交能力。1.4.2 埋珠实验 埋珠实验检测大鼠腔室重复刻板行为。参照本实验室已建立的实验方法［9］，在45 cm×25 cm×18 cm 大小的箱体底部平铺5 cm 厚木屑垫料，以4×4的排列方式，将20 颗黑色玻璃珠（直径15 mm）放置在木屑上。记录大鼠在箱体15 min埋珠数量（玻璃珠埋入体积>60%）和移动距离。1.4.3 旷场和高架十字迷宫实验 旷场实验检测大鼠自主行为及焦虑变化。实验装置为100 cm×100 cm×45 cm 方形灰色树脂盒。将大鼠放入旷场反应箱内底面中心，记录大鼠15 min 在中央区域停留时间和运动距离。高架十字迷宫实验评价动物的焦虑状态。高架十字迷宫装置由2个交叉的开臂和2个闭臂组成。将大鼠从中央区域面朝开放臂放入，记录 10 min大鼠在开臂停留时间和移动距离。1.5 免疫荧光实验 免疫荧光检测大鼠海马CA1区神经特异核蛋白（NeuN）阳性的神经元数量。参考大鼠脑立体定位图谱，前囟后2.56~4.30 mm。每组6只，每只动物选取5张组织切片，每个切片选取3~4个视野进行计数。1.6 高尔基染色实验 检测大鼠海马锥体神经元树突棘密度和形态。每只大鼠选择8个神经元，选取海马CA1区锥体神经元顶树突处于距胞体100 μm以外的二级分支，运用德国蔡司显微镜进行Z-stack照相，记录大鼠树突棘形状（丝状伪足、瘦长型、短粗型和蘑菇型）。运用MetaMorph统计树突棘密度，每个海马CA1区锥体神经元在上述区域任意挑选一段长50 μm的树突，数该段树突上树突棘个数，计算树突棘密度，单位为个/μm。1.7 Western blot实验 提取大鼠海马组织总蛋白,凝胶电泳分离目的蛋白，聚偏二氟乙烯转膜，脱脂牛奶封闭 2 h，孵育一抗［磷酸化LIMK1（1∶1 000）、LIMK1（1∶1 000）、磷酸化Cofilin （1∶1 000）、Cofilin（1∶1 000）、F-actin （1∶1 000）、球状肌动蛋白（G-actin）（1∶1 000）、Drebrin A（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）］，4 ℃ 摇床过夜。孵育辣根过氧化酶标记的羊抗兔/鼠的IgG（1∶1 000），室温2 h。运用增强型发光试剂盒进行显影曝光。1.8 统计学处理 采用GraphPad Prism v9.0软件进行统计分析。数据以x̄±s表示。采用单因素方差分析统计学差异，以Tukey法进行组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。
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结果2.1 ICG-001对孤独症大鼠社交和重复刻板行为的影响 三箱社交实验检测结果表明，与生理盐水对照组相比，VPA组大鼠与新奇大鼠接触时间显著降低（P<0.05），ICG-001处理组与新奇大鼠接触时间增加（P<0.05），接近于生理盐水对照组水平（P>0.05）。与生理盐水对照组相比，VPA组大鼠偏好指数降低（P<0.05），ICG-001处理组偏好指数增加（P<0.05），接近于生理盐水对照组水平（P>0.05）（表1）。埋珠实验结果表明，与生理盐水对照组相比，VPA组埋珠数量显著增加（P<0.05），ICG-001处理组埋珠数量减少（P<0.05），接近于生理盐水对照组水平（P>0.05）；VPA组与ICG-001处理组运动距离比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。
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讨论孤独症主要临床特征包括社会交往障碍、重复性刻板行为，并伴焦虑样症状。近年来研究报道，小分子化合物ICG-001通过抑制β-catenin与CBP的相互作用，降低转录复合物的活性，从而抑制Wnt靶基因的表达。Wnt/β-catenin信号通路参与孤独症症状发生［8］。因此，本研究重点探究ICG-001对大鼠孤独症症状、海马树突棘形态、磷酸化LIMK1和Cofilin、F-actin和Drebrin A蛋白表达的影响。三箱社交、埋珠、旷场和高架十字迷宫实验分别用于评价动物社交新奇偏好、重复刻板和焦虑情绪［11］。大多数孤独症模型动物存在社交障碍、重复刻板行为和焦虑［11-12］。本研究结果显示，VPA组大鼠与社交鼠接触时间和偏好指数降低、埋珠数量增加、在中央区域停留时间和开臂停留时间降低；而ICG-001使孤独症大鼠与新奇大鼠接触时间和偏好指数增加、埋珠数量减少、在中央区域停留时间和开臂停留时间增加。这表明 ICG-001 能够减轻孤独症大鼠的社交行为障碍、重复刻板和焦虑样行为。海马结构异常是引起孤独症重要的病理学基础［13］。NeuN是中枢神经系统成熟神经元的特异性标志物，本研究结果表明，VPA诱导的孤独症大鼠NeuN免疫阳性神经元数量显著降低，与文献报道相一致［13］。ICG-001使孤独症大鼠NeuN阳性神经元数量得到较大改善。这表明ICG-001处理可促进孤独症大鼠海马CA1区神经元成熟。海马树突棘密度和形态异常与孤独症症状密切相关［3,14］。本研究结果证实，VPA诱导的孤独症大鼠CA1区锥体细胞顶树突棘密度降低，与文献报道一致［4］，ICG-001使孤独症大鼠海马顶树突棘密度增加。瘦长型与丝状伪足型树突棘为不成熟型，蘑菇型与短粗型树突棘为成熟状态。本研究结果表明，VPA组大鼠海马CA1区锥体细胞蘑菇型顶树突棘减少和顶瘦长型树突棘增多，与文献报道一致［15］；ICG-001使孤独症大鼠海马锥体细胞蘑菇型顶树突棘增多和长型顶树突棘减少。这表明ICG-001能够促进孤独症大鼠树突棘形态发育。LIMK1是哺乳动物中主要的Cofilin调节激酶，磷酸化Cofilin失活，失去解聚F-actin能力，而去磷酸化Cofilin 保持F-actin的稳定性［7］。特异性敲除LIMK1基因，能够降低海马神经元树突棘数量［5］。睡眠剥夺小鼠LIMK1和Cofilin磷酸化水平降低，引起海马CA1区树突棘密和蘑菇型树突棘减少［16］。基于以上理论和研究结果，本研究发现VPA降低大鼠海马LIMK1磷酸化水平，使Cofilin的磷酸化水平降低，F-actin/G-actin比值降低，这表明其抑制F-actin形成。此外，Drebrin A参与树突棘形态发育［17］；敲减海马神经元Drebrin A基因能够减少F-actin生成，抑制树突棘形成［18］。本研究结果显示，VPA组Drebrin A 低表达，表明VPA通过降低 Drebrin A 的表达减轻对Cofilin 的拮抗作用，使F-actin 失去稳定结构。本研究进一步研究发现，ICG-001处理能够上调孤独症大鼠磷酸化LIMK1和Cofilin、F-actin/G-actin 比值和Drebrin A表达。文献报道，BNDF 增强LIMK1 的活性，增加Cofilin磷酸化，诱导F-actin的生成，促进树突棘形态发育［19］，本研究结果与之一致。这表明ICG-001可能通过上调LIMK1/Cofilin磷酸化水平、促进F-actin形成和上调 Drebrin A蛋白表达，增强树突棘形态发育。综上，VPA诱导的孤独症大鼠海马LIMK1/Cofilin磷酸化水平、F-actin和Drebrin A表达下调，进而使蘑菇型树突棘减少和瘦长型树突棘增多。ICG-001可能通过调控LIMK1/Cofilin通路、促进F-actin形成和上调Drebrin A蛋白表达，增强海马树突棘形态发育，进而改善大鼠孤独症样行为。本研究将为ICG-001治疗孤独症及新药的研发提供理论依据。
参考文献略
本文编辑：廉珍珍
数字编辑：郑成铭
制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部
《中华实用儿科临床杂志》
面向临床
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