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作者：杨三菊 陈丽蓥 刘运广 林娜 颜嘉葳 李建 王琼 张晓旭通信作者：刘运广，Email：lyg9226@163.com作者单位：右江民族医学院附属医院儿科，百色 533000本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2023,38(6):444-447.引用本文：杨三菊,陈丽蓥,刘运广,等.广西壮族儿童原发性肾病综合征PLCE1基因多态性检测的意义[J].中华实用儿科临床杂志,2023,38(6):444-447.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20221030-01225.
摘要
目的 探讨PLCE1基因单核苷酸多态性（SNP）与广西壮族儿童原发性肾病综合征（PNS）的相关性。方法 本研究为回顾性研究，采用病例对照研究选取2017年1月至2021年1月在右江民族医学院附属医院就诊的广西壮族儿童PNS 155例（PNS组），同期体检的广西壮族健康儿童100例（健康对照组），采用二代基因测序技术对PLCE1 SNP rs3765524、rs2274223进行基因分型，并分析其与PNS发病的相关性。相关性分析采用Logistic回归分析，组间比较采用χ2检验或Fisher′s确切概率法。结果 1.与健康对照组比较，PNS组患儿中PLCE1 rs3765524 与广西壮族儿童PNS的发病风险关联，在共显性模型中TT基因型可能降低广西壮族儿童PNS发病风险（OR=0.435，95%CI：0.238~0.794，P=0.007）；PLCE1 rs2274223位点基因型及等位基因分布频率差异均无统计学意义（均P>0.05）。2.PLCE1基因 rs3765524、rs2274223两位点存在强连锁不平衡。3.PNS组与健康对照组中单倍体型AC、AT、GT分布频率差异均无统计学意义（均P>0.05）。结论 PLCE1基因rs3765524位点的SNP可能与广西壮族儿童PNS发病风险关联，TT基因型可能为广西壮族儿童PNS的保护基因。
关键词
壮族；儿童；原发性肾病综合征；PLCE1；单核苷酸多态性
原发性肾病综合征（PNS）是以大量血浆白蛋白丢失为特征，继发低蛋白血症、高胆固醇血症和水肿等一系列病理生理改变的临床综合征。其发病的关键部位在足细胞，因此，涉及足细胞的相关基因成为肾病综合征（NS）研究的热点，如PLCE1基因［1-2］。有文献报道，PLCE1表达于发育和成熟的肾小球足细胞上，该基因的敲除影响了足细胞的增殖、迁移和分化，导致足细胞呈现不成熟状态，该足细胞变化符合弥漫性系膜硬化（DMS）的病理［3］ 。另外，Warejko等［4］报道了来自不同国家的300个家庭中激素耐药型肾病综合征（SRNS）基因突变情况，PLCE1突变检出率为3.7%，是导致SRNS最常见的4个突变基因之一。Almokali等［5］ 回顾了沙特阿拉伯2015年至2019年诊断为NS的儿科患者资料，对符合标准的35例NS患儿进行研究筛查，结果显示PLCE1是最常见的纯合突变。PLCE1基因突变参与NS发病已被大量研究证实，而该基因单核苷酸多态性（SNP）位点的研究主要集中在消化道肿瘤方面，其中rs3765524、rs2274223是报道最多的SNP位点［6］。目前这2个SNP位点与壮族儿童PNS发病的相关性尚未见报道。本研究采用二代基因测序技术对155例广西壮族PNS患儿和100例广西壮族健康儿童PLCE1基因上的 rs3765524、rs2274223位点进行检测，通过基因关联性、单倍体及连锁不平衡（LD）探讨PLCE1基因SNP位点与广西壮族儿童PNS发病的相关性。给PNS的诊疗和预后的判断提供新的思路，同时也为揭示该病的发病机制提供依据。
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资料与方法1.1 临床资料 本研究为回顾性研究。收集2017年1月至2021年1月在右江民族医学院附属医院就诊的广西壮族PNS患儿155例。其中男90例，女65例；年龄（9.3±3.2）岁。PNS诊断标准参照中华医学会儿科学分会肾脏病学组制定的儿童激素敏感、复发/依赖肾病综合征循证诊治指南［7］ ，健康对照组为右江民族医学院附属医院同期体检的广西壮族健康儿童100例。其中男66例，女34例，年龄（9.0±3.2）岁。右江民族医学院附属医院就诊者来自广西大部分壮族地区，如河池市、百色市、南宁市、崇左市等，可代表广大的广西壮族人群，具有代表性。两组研究对象的家族中未发现肾脏疾病且祖辈三代均为壮族，相互之间无血缘关系。两组年龄及性别差异均无统计学意义(均P>0.05)。本研究已告知研究对象监护人，并签署知情同意书。本研究通过医院医学伦理委员会批准（批准文号：2014101001）。1.2 方法 1.2.1 SNP位点的选择 通过美国国立生物技术信息中心数据库查询，查找已登记PLCE1基因SNP位点，以中国北京人群为参照选取最小等位基因频率>0.05的SNP位点，结合已发表的文章，对可能与疾病相关联的SNP位点进行初步研究，最终选取了rs2274223、rs3765524进行研究。1.2.2 PLCE1基因多态性的检测 DNA提取：于清晨对2组研究对象空腹抽取2 mL外周静脉血，置于乙二胺四乙酸抗凝试管中，存放于-80 ℃冰箱内待检，采用德国Qiagen公司DNeasy Blood & Tissue Kit全血DNA提取试剂盒按照实验步骤提取DNA，并纯化全血基因组DNA。FastTarget目标区域测序：以标准人基因组为模板，委托上海天昊生物科技有限公司设置目标区域的引物，以样品基因组为模板进行多重PCR扩增，同时加入Index序列的引物向文库末端引入特异性标签序列，将所有样品IndexPCR扩增产物等量混合，割胶回收获得最终的FastTarget测序文库，经过高通量测序获得FastQ数据。1.3 统计学处理 数据应用SPSS 22.0软件及plink1.9全基因组关联分析软件进行分析，使用Hardy-Weinberg平衡检验，评估健康对照组是否具有群体代表性。采用t检验分析各组之间年龄分布差异。χ2检验分析各组间性别分布差异。采用χ2检验或Fisher′s确切概率法分析各组间基因型、等位基因分布差异。对多态性位点基因型与患病风险的关联分析则采用plink软件中二分类Logistic 回归分析的方法，计算比值比（OR）及95%可信区间（CI）。采用SHEsis软件对PLCE1基因各SNP位点的LD进行分析，并构建单倍体型，单倍体型分布频率差异采用χ2检验或Fisher′s确切概率法，P<0.05为差异有统计学意义。
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结果2.1 SNP位点与PNS发病风险关系 对健康对照组rs3765524、rs2274223位点进行Hardy-Weinberg平衡分析，两位点的基因型频数符合Hardy-Weinberg平衡（rs3765524：χ2=3.593，P=0.058；rs2274223：χ2=1.985，P=0.159），样本有群体代表性。PNS组与健康对照组中rs3765524、rs2274223位点在共显性、显性、隐性分析模型下分析两组的基因型频率，提示两组rs3765524位点在共显性遗传模型下基因型分布差异有统计学意义（χ2=7.821，P=0.020）（表1）。在共显性、显性、隐性、叠加4种遗传模型下纳入性别、年龄因素进行Logistic回归分析，提示rs3765524位点与广西壮族儿童PNS发病风险有关联，在共显性模型下TT基因型降低广西壮族儿童PNS发病（OR=0.435，95%CI=0.238~0.794，P=0.007）（表2）。rs2274223位点与广西壮族儿童PNS发病无关联。
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讨论PLCE1位于人染色体10q23.3区，是长为334.4 kb的单拷贝基因，含有34个外显子。其编码的PLCE1蛋白在秀丽隐杆线虫中第1次被发现，属于磷脂酶C家族，结构极为复杂，除保守结构域（XY、PH、EF、C2）外，还包含了2个特有的结构域（RasEGF_CDC25、RA）［2］。分布在不同位置的结构域具有不同的生物学功能，在细胞信号转导过程中同样起重要作用，继而调节细胞的生长、分化和基因表达的各种过程。因此，PLCE1基因也参与众多疾病的发生及发展，如肾脏疾病、心脏疾病、肿瘤疾病等［8-10］。近年来PLCE1基因及其编码的蛋白在NS疾病的研究中有了长足的进展，相关报道越来越多。Sadowski等［11］对1 783个不同家庭进行外显子测序发现PLCE1突变导致早发型SRNS，病理类型以DMS最常见（检出率为17.8%），并首次发现PLCE1的基因型与表型具有相关性：其特定突变与发病年龄相关剪接位点突变较C末端截短突变或错义突变发病年龄明显更早。McCarthy等［12］在先天性肾病综合征(CNS)患者中检测到PLCE1突变（R321X），这种突变导致患者出现DMS表型。在对7个来自突尼斯家庭中的局灶节段性肾小球硬化（FSGS）患者进行基因测序发现了PLCE1基因的新突变（c.5186G>A），证实了 PLCE1突变可导致家族性FSGS［13］。另外有文献报道PLCE1突变是导致NS早期发病，且在家族中常染色体隐性遗传的原因［14］。既往研究发现，PLCE1突变与CNS、SRNS等NS疾病相关；PLCE1基因的SNP位点与食管癌、肝癌及登革热等疾病相关［15-17］ ，与NS疾病相关性的报道十分罕见。本研究在广西壮族儿童中检测了PLCE1基因rs3765524及rs2274223两个SNP位点基因型及等位基因型，同时构建两位点单倍体型，探讨这两个SNP位点与该地区壮族儿童PNS的相关性。国内外目前尚未见关于PLCE1基因rs3765524、rs2274223位点多态性与PNS相关性的报道。Li等［18］通过meta分析发现rs3765524多态性在特定的遗传模式中降低总体癌症易感性，rs2274223多态性增加亚洲人的癌症易感性，但与白种人癌症发病风险无关。提示种族、地区、特定遗传模式等因素可能影响两位点与疾病易感性的关系。Liang等［19］通过免疫组织化学检测发现rs3765524 CT/TT组的PLCE1蛋白表达高于CC组。提示rs3765524多态性可能引起蛋白质修饰或结构变化导致PLCE1的表达或稳定受影响。关于PLCE1基因rs3765524、rs2274223两个SNP位点具体致病机制尚不明确，可能与PLCE1蛋白结构域相关：rs3765524和rs2274223两个SNP位点的位置分别在PLCE1蛋白的Y结构域和C2结构域中，位于1744-1846位氨基酸的Y结构域与PLCE1蛋白激活相关，位于1871-1953位氨基酸的C2结构域则与钙离子的结合相关，两结构域在PLCE1蛋白执行相关生物学功能中扮演重要角色。有研究发现，rs3765524突变导致1771位点氨基酸发生改变，影响Y结构域的催化功能；rs2274223改变了1927位点的氨基酸，影响了C2结构域功能［6］。因此，rs3765524及rs2274223可能通过Y及C2结构域参与PLCE1蛋白功能执行，从而影响疾病的发生及发展。同样，张研等［20］在患有PNS的壮族人群中发现PLCE1突变位点（c.578T>C、c.670C>T、c.923G>T、c.4916C>T、c.5927_5929del），这些突变位点导致NS可能与突变后PLCE1蛋白结构域功能改变相关，其中c.4916 C>T 造成XY结构域中氨基酸改变，影响该结构域的功能。本研究在广西壮族儿童人群中发现PLCE1基因SNP rs3765524与PNS发病风险相关联，在共显性模型下以CC基因型为参照，TT基因型患PNS的风险是CC基因型的0.435倍（OR=0.435，95%CI=0.238~0.794，P<0.05），这表明rs3765524位点TT基因型可能降低PNS的发病风险。目前国内外无类似报道，TT基因型可能为广西壮族儿童PNS新发现的保护基因型。而rs2274223位点与广西壮族儿童PNS发病无关。为了确定rs3765524、rs2274223位点之间是否相互作用，本研究使用SHEsis软件对两位点进行LD、单倍体分析，发现两位点之间存在强LD（D′=0.975，r2=0.673），对两位点进行单倍体构建，发现存在AC、AT、CT 3种单倍体。通过分析发现该3种单倍型与PNS发病风险无关。在研究中发现rs2274223位点基因型及等位基因在PNS组及健康对照组中分布差异无统计学意义，与上述报道不符，考虑有以下几点原因：（1）同一SNP位点在不同的疾病中作用不同，与有些疾病发生及发展相关，与有些疾病无关；（2）SNP位点与疾病易感性在不同种族、地域及遗传模式上存在差异；（3）本研究只选取255例样本，样本量太小，如果增加样本量可能得出不同的结果。综上，本研究首次报道了PLCE1基因rs3765524、rs227423位点多态性及单倍体与广西壮族儿童PNS相关性的情况，并首次发现rs3765524位点在显性模型下TT基因型可能为广西壮族儿童PNS保护因素。为广西壮族地区的PNS患儿在临床上制定个体化治疗及预后判断提供一定的数据及方向。但由于本研究样本量少、来源单一，且只选取了该基因的其中两位点进行研究，因此本研究结果还需深入研究证实，而关于PLCE1基因SNP多态性与广西壮族儿童PNS相关性的研究也还需进一步探讨。作者贡献声明：杨三菊：实施研究、采集数据、论文撰写；陈丽蓥、颜嘉葳：实施研究、采集数据；刘运广：研究设计、经费支持、文章撰写指导、修改论文；林娜：研究指导、论文修改；李建、王琼、张晓旭：统计分析
参考文献略
本文编辑：范艳芬
数字编辑：郑成铭
制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部
《中华实用儿科临床杂志》
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