点击蓝字 关注我们
作者：岳志霞1 邢天禹1 蒋持怡2 王希思2 赵文2 段超2 苏雁2 金眉2 高超1 马晓莉2通信作者：马晓莉，Email：mxl1123@vip.sina.com作者单位：1国家儿童医学中心,首都医科大学附属北京儿童医院血液病中心,儿童血液病与肿瘤分子分型北京市重点实验室,儿科学国家重点学科,儿科重大疾病研究教育部重点实验室,北京市儿科研究所血液疾病研究室，北京 100045;2国家儿童医学中心，首都医科大学附属北京儿童医院儿童肿瘤中心肿瘤内科，北京市儿童血液肿瘤重点实验室，儿科重大疾病研究教育部重点实验室，北京 100045本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(4):290-294.引用本文：岳志霞,邢天禹,蒋持怡,等.MYCN和PHOX2B基因联合血浆游离DNA检测在高危神经母细胞瘤危险度分层及预后评估中的作用[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(4):290-294.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20200710-01160.
摘要
目的 探讨MYCN基因、PHOX2B基因及血浆游离DNA（cfDNA）水平用于高危神经母细胞瘤(NB)危险度分层及预后评估的作用和意义。方法 对2017年8月至2018年12月首都医科大学附属北京儿童医院收治的94例高危NB患儿进行前瞻性研究，分别于初诊时、化疗4个疗程和6个疗程后检测MYCN基因、PHOX2B基因及cfDNA水平，观察治疗过程中3项指标的变化,采用χ2检验和Kaplan-Meier生存分析法评价其与疗效的关系。结果 94例患儿中MYCN基因扩增14例（14.9%），PHOX2B基因阳性76例（80.8%），cfDNA水平>100 μg/L者56例（59.6%）。MYCN基因扩增患儿初诊高乳酸脱氢酶(LDH,≥1 500 U/L)比例(6/14例)显著高于基因正常组患儿(9/80例)（P=0.009）；PHOX2B基因阳性患儿多部位转移病例(54/76例)及高神经元特异性烯醇化酶(NSE，≥370 μg/L)比例(37/76例)显著高于基因阴性组患儿(5/14例,2/14例)（P=0.015、0.020）；cfDNA高水平患儿初诊高LDH及高NSE比例(13/37例,28/37例)显著高于cfDNA低水平组患儿(2/48例,10/48例)（均P<0.001）。治疗过程中，随着肿瘤负荷减小，PHOX2B基因拷贝数和 cfDNA 水平较初诊时显著降低［0（0~719.6）拷贝比1 723.5（0~186 000.0）拷贝；19.0（1.1~225.5） μg/L比200.6（8.0~5 247.4） μg/L］（均P<0.001）。初诊时，MYCN基因扩增组患儿2年无事件生存（EFS）率显著低于MYCN基因正常组患儿［（33.3±13.1）% 比 （58.5±7.1）%,P=0.020］；PHOX2B基因阳性组患儿2年EFS率显著低于阴性组患儿［（47.9±7.1）% 比 （79.1±11.1）%,P=0.043］；cfDNA高水平组(≥229.6 μg/L)2年 EFS率显著低于cfDNA低水平组［（38.6±9.8）% 比 （71.7±8.2）%,P=0.001］。6个疗程后PHOX2B基因阳性组患儿 2年EFS率显著低于基因阴性组患儿［（16.7±14.4）% 比 （60.6±6.6）%,P=0.014］；维持治疗前间碘苄胍(MIBG)核素扫描阳性组患儿2年EFS率显著低于阴性组患儿［（35.2±11.7）% 比 （65.8±7.1）%,P=0.037］。治疗过程中，MYCN基因和cfDNA水平与患儿预后无显著相关性。将6个疗程后的PHOX2B基因及维持治疗前MIBG结果联合分组进行生存分析（PHOX2B+/MIBG+,PHOX2B+或MIBG+,PHOX2B-/MIBG-），组间比较差异有统计学意义［0 比 （53.6±1.2）% 比 （65.5±7.4）%，P=0.003］。结论 MYCN和PHOX2B基因及cfDNA水平在高危NB危险度分层及预后评估中具有重要作用；与MYCN和cfDNA水平相比，PHOX2B基因更适于治疗过程中的疗效监测，PHOX2B与维持治疗前的MIBG结果联合分析，用于判断患儿治疗效果，评估体内残余病灶更精准。
关键词
神经母细胞瘤；高危；微小残留病；MYCN基因；PHOX2B基因；血浆游离DNA
神经母细胞瘤(NB)是起源于交感神经系统的恶性胚胎瘤，是5岁以下儿童最常见的颅外实体肿瘤，占婴幼儿期恶性肿瘤的8%~12%，在儿童肿瘤性死亡中高达15%［1］。近年来，在联合化疗、放疗、手术、骨髓移植及免疫治疗等综合治疗的支持下，NB治疗取得实质性进展，低、中危NB的存活率已达90%以上［2］。然而，约50%的NB患儿在确诊时即为高危，高危患儿即使经过多元化治疗，仍有约60%病例复发，其5年生存率不足40%，这成为NB疗效进一步提高的主要障碍［3］。复发是导致高危患儿低生存率的主要原因，而初诊时不精准的危险度分层以及治疗过程中骨髓或外周血中微小残留病（MRD）的存在，又是NB复发进展的根本原因［4］。本研究探讨MYCN和PHOX2B基因及血浆游离DNA（cfDNA）水平用于高危NB的危险度分层及其在治疗过程中评估肿瘤负荷及判断预后的作用，为早期识别疾病进展，建立高危NB患儿MRD监测体系、改善患儿预后提供重要依据。
1
资料与方法1.1 研究对象 前瞻性研究。纳入2017年8月至2018年12月首次就诊于首都医科大学附属北京儿童医院血液病中心，符合高危NB诊断标准［5］，且年龄<18岁的患儿。临床分期参考国际NB分期系统（INSS），危险度分组参考美国儿童肿瘤协作组（COG）标准。排除标准：临床资料不全、未在本中心接受系统治疗者。共纳入94例，其中男54例，女40例，男女比例为1.4∶1.0；年龄5~117个月，中位年龄47个月；94例高危患儿中92例(97.9%)发生远处转移。本研究患儿监护人均签署知情同意书，并通过医院医学伦理委员会批准（批准文号：2019-56）。1.2 方法1.2.1 荧光原位杂交(FISH)检测 MYCN/CEP2双色探针购自美国Vysis公司，按照本实验室的FISH操作规程及判读标准进行操作和结果判读［6］。1.2.2 PHOX2B基因检测 采用实时PCR(qPCR)技术检测PHOX2B基因表达水平。PHOX2B基因结果为每10 000个β-葡萄糖苷酸酶（GUS）内参基因拷贝中所含PHOX2B基因拷贝数，拷贝数>0为阳性。1.2.3 血浆cfDNA检测 乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝静脉血，1 600×g离心10 min分离血浆。采用PCR技术检测血浆cfDNA水平。根据标准曲线计算待测样品血浆cfDNA水平。1.3 治疗及疗效评估 患儿均按照北京儿童医院高危NB方案（BCH-HR-NB方案）进行治疗和疗效评估［7］。治疗总疗程1.0~1.5年。分别于化疗第2、4、6个疗程后，行骨髓穿刺、肿瘤标志物及影像学检查，评估瘤灶大小及转移部位。随访至2020年3月31日。无事件生存（event-free survival,EFS）定义为从初诊截至任何事件发生的时间，或至缓解期最后1次随访的时间。1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计数资料采用百分率描述，利用精确概率法χ2检验比较各组计数资料间的差异；正态分布的计量资料采用x̄±s表示，组间比较采用配对样本t检验；非正态分布的计量资料采用中位数（范围）表示，组间比较采用Wilcoxon检验。预后分析采用Kaplan-Meier生存分析法，比较各组间2年EFS率的差异，P<0.05为差异有统计学意义。
2
结果2.1 一般资料 NB 94例患儿初诊时临床特征见表1。
3
讨论NB是儿童最常见的颅外实体肿瘤，极易发生早期转移，本研究94例高危患儿中，92例在确诊时已发生远处转移（97.9%），其中骨髓转移高达79.8%。研究表明，初诊时精确的危险度分层和在治疗过程中密切监测肿瘤细胞的MRD水平，有利于评估肿瘤负荷、评价药物反应、适时调整危险度，从而减少肿瘤复发和转移，改善高危患儿长期预后［8］。现有MRD评估方法，包括影像学、形态学、免疫细胞化学等均存在不同程度的局限性，临床缺乏能够早期识别并易于监测MRD水平的评价指标［9］。MIBG核素扫描法是NB影像学诊断“金标准”，临床主要用于高危NB患者疗效监测及早期复发病灶探查。但因其具有放射活性，且检查程序繁杂，全国仅几家医院能够开展，不适合动态监测。MYCN基因扩增是NB患儿的独立预后因素，可用于患儿MRD监测［10］。但临床工作中，MYCN基因对预测NB患儿的MRD水平作用有限。首要原因为MYCN基因扩增阳性率不高。国外文献报道的MYCN基因扩增阳性率约为20%［11］，本研究中MYCN基因扩增阳性率为14.9%，略低于国外报道。其次，患儿原发瘤灶一经手术切除，后期难以用常规病理方法来监测MYCN基因。本研究中MYCN基因扩增患儿2年生EFS率明显低于基因无扩增患儿，但9例初诊时有骨髓转移的MYCN 基因扩增患儿进行监测，发现治疗过程中9例患儿的MYCN基因均为阴性，而其中3例维持治疗前的 MIBG 结果为阳性，推测原因与骨髓标本中无肿瘤细胞或肿瘤细胞数量很少有关。提示MYCN基因扩增主要在病初的危险度分层及预后判断上作用明显。本研究还同时检测了1号染色体短臂末端杂合性缺失（1pLOH)以及染色体11q23区段缺失，二者的阳性率均高于MYCN基因。1pLOH和11q23缺失与NB不良预后相关［12］，未来将多种分子遗传异常联合检测，应用于MRD监测值得深入探讨。qPCR方法检测肿瘤细胞具有较高敏感性，且PCR方法简单、易操作，是NB患儿MRD监测的首选方法，但其特异性则由靶RNA的特异性决定。既往有文献选择酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）作为检测靶点［13］，但采用TH作为NB的MRD评估靶点准确性较低。TH的表达缺乏特异性，在正常组织中也有表达，并且在不同个体、不同肿瘤细胞，甚至原发灶与转移灶之间的表达存在较大差异。PHOX2B基因是参与肾上腺髓质和交感神经系统发育的转录因子，特异性表达于NB肿瘤细胞中，正常细胞不表达［14］。以PHOX2B为靶基因用于监测NB患儿MRD水平，目前国内未见报道。本研究采用qPCR法检测94例高危NB患儿骨髓细胞中的PHOX2B基因，发现PHOX2B基因阳性率高达80.8%。通过随访监测，发现PHOX2B基因拷贝数与患儿的肿瘤负荷密切相关，随着原发瘤灶的减小，PHOX2B基因拷贝数也明显降低。生存分析提示PHOX2B基因适于高危NB患儿MRD监测，与MIBG联合用于判断患儿治疗效果，评估体内残余病灶更精准。研究发现，cfDNA是潜在的肿瘤标志物，其在食管癌、结直肠癌、肺癌等多种实体瘤中升高［15］。本课题组前期研究证实，NB患儿cfDNA水平较健康组明显升高，且与肿瘤负荷密切相关，与传统的NB肿瘤标志物LDH和NSE相比，cfDNA具有更高的敏感性和特异性［16］。在此基础上，本研究继续观察了cfDNA与治疗反应的关系，发现初诊时cfDNA水平与治疗反应密切相关。尽管治疗后，随着原发瘤灶的减小，cfDNA水平也明显下降，但治疗4个疗程、6个疗程后，cfDNA水平均与患儿预后无关，提示其作为MRD监测指标能力有限。分析可能原因，能够影响cfDNA的因素较多，如发热、运动、应激等，而处于化疗期间的NB患儿生理状态极不稳定，因此 cfDNA值不能准确反映患儿体内的MRD水平。综上，MYCN和PHOX2B基因及cfDNA水平均可用于高危患儿危险度分层，PHOX2B基因更适于NB治疗过程的疗效监测，其与维持治疗前的MIBG结果联合分析，用于判断患儿治疗效果，评估体内残余病灶更精准。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
点击“阅读原文”免费下载PDF全文