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作者：禹定乐1 梁云梅2 卢清华1 赵瑞珍1 陈运生3 郑跃杰1 杨永弘1,4通信作者：杨永弘，Email：yyh628628@sina.com作者单位：1深圳市儿童医院呼吸科，深圳 518038；2首都医科大学附属北京朝阳医院儿科，北京 100043；3深圳市儿童医院检验科，深圳 518038；4首都医科大学附属北京儿童医院微生物实验室，北京 100045本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(4):295-298.引用本文：禹定乐,梁云梅,卢清华,等.深圳儿童酿脓链球菌分离株多基因序列分型[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(4):295-298.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20201109-01737.
摘要
目的 探讨酿脓链球菌，即β溶血性A族链球菌（GAS）在深圳的流行病学特征。方法 对2016年1月至2018年12月深圳市儿童医院分离的GAS流行克隆群进行多基因序列分型(MLST) 回顾性分析。本研究中32株分属于7个不同emm分型的GAS菌株分别来自32例患有脓疱病、蜂窝组织炎、猩红热、脓毒症、肺炎、阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征、支气管炎、过敏性鼻炎、臀部脓肿、过敏性紫癜或咽扁桃体炎的患儿，分离自咽拭子23份，痰液5份，脓液3份和血液1份。应用聚合酶链反应技术对32株GAS菌株的7对等位看家基因（gki、gtr、murI、mutS、recP、xpt和yqiL）进行扩增，对目标基因产物进行测序。然后将获得的每个等位基因的基因序列提交至MLST网站，以获得相应的等位基因谱。最后将等位基因谱再次提交至MLST网站，以确认序列分型（ST)。结果 emm 1.00及其亚型、emm 4.00、emm 12.00及其亚型、emm 22.00、emm 28.00、emm 75.00和emm 89.00的GAS克隆群分别属于MLST分型中的ST28、ST39、ST36、ST46、ST52、ST49和ST921。结论 2016年至2018年导致深圳地区儿童感染的GAS分离株的MLST流行克隆群分别为ST28、ST39、ST36、ST46、ST52、ST49和ST921。
关键词
酿脓链球菌；多基因序列分型；emm分型；儿童
酿脓链球菌，即β溶血性A族链球菌（β-hemolytic Group A Streptococcus，GAS），是链球菌中致病性最高的细菌，也是引起儿童传染病的重要病原体。GAS感染性疾病在世界范围内的儿童中具有很高的发病率和死亡率，在全球低收入国家中，目前每年有超过50万患者死于链球菌感染引起的各种疾病［1］。GAS是严格的人类细菌性病原体，可引起多种临床疾病，如猩红热、咽炎、风湿热、肾小球肾炎、脓毒症、坏死性筋膜炎、脑膜炎和链球菌中毒性休克综合征［2］。近年来，欧美国家关于侵袭性GAS感染的报道逐渐增多［3］。儿童风湿性心脏病和风湿热在全球范围内呈上升趋势［4-5］。链球菌中毒性休克综合征和坏死性筋膜炎亦不少见［6］。在过去的15年中，中国儿童暴发了链球菌感染后肾小球肾炎和猩红热［7-8］。GAS克隆群的分布随着地理位置和流行年代的变化而迁移。为探讨GAS在深圳的流行病学特征，本研究对2016年至2018年导致深圳儿童患有不同疾病且分属于7个不同emm 分型的32株GAS流行克隆群行多基因序列分型(multilocus sequence typing,MLST) 回顾性分析。
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资料与方法1.1 菌株来源 回顾性研究。收集2016年1月至2018年12月深圳市儿童医院门急诊和内科病房的感染儿童中32株被鉴定为emm 1.00及其亚型、emm 4.00、emm 12.00及其亚型、emm 22.00、emm 28.00、emm 75.00和emm 89.00 的GAS菌株。这些GAS菌株的致病谱包括猩红热（14株）、阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAS）（5株）、肺炎（3株）、支气管炎（2株）、过敏性紫癜（2株）、脓疱病（1株）、蜂窝组织炎（1株）、脓毒症（1株）、过敏性鼻炎（1株）、臀部脓肿（1株）和咽扁桃体炎（1株）。其中23份样本来自咽拭子，5份样本来自痰液，3份样本来自脓液，1份样本来自血液 (表1)。本研究获得深圳市儿童医院医学伦理委员会批准（批准文号：2019012）， 患儿监护人均知情同意。1.2 试剂 链球菌诊断试剂盒购自Oxoid Company（英国）。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）所需相关试剂和DNA提取试剂盒购自上海生物技术有限公司。1.3 MLST分型1.3.1 PCR引物 所有PCR引物由上海生物技术有限公司合成。7对GAS等位看家基因 (gki、gtr、murI、mutS、recP、xpt和yqiL) MLST分型PCR扩增用引物序列引自文献报道［9］。1.3.2 DNA提取 将32株GAS菌株接种到含50 mL/L去纤维蛋白羊血的胰酶大豆琼脂培养皿上，并在50 mL/L 二氧化碳（CO2） 37 ℃恒温箱中孵育18~24 h。用DNA提取试剂盒提取DNA，以提取的DNA作为模板，用于MLST分型中7个管家基因的PCR扩增。DNA提取严格按照试剂盒说明规范执行。1.3.3 PCR 反应体系：2 μL DNA模板，正向和反向引物（10 mmol/L）各2 μL，25 μL 2×Taq PCR混合物和19 μL蒸馏水。1.3.4 PCR反应条件 94 ℃变性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min进行30个循环，再72 ℃延伸5 min。1.3.5 MLST分型 PCR扩增产物送至上海生物技术有限公司，将初始扩增引物作为测序引物，对每个看家基因片段的序列进行双向测序。每株GAS菌株扩增的7对等位基因的DNA序列与在GAS MLST网站（https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_spyogenes_seqdef）上发布的相应等位基因序列进行比较，以获得菌株的等位基因谱。然后将等位基因谱重新提交给MLST网站，可确定其序列分型（sequence typing,ST)。
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结果emm 1.00及其亚型、emm 4.00、emm 12.00及其亚型、emm 22.00、emm 28.00、emm 75.00和emm 89.00的GAS克隆群分别属于MLST分型中的ST28、ST39、ST36、ST46、ST52、ST49和ST921。32株来自32例患不同疾病、分属于不同emm 分型及其亚型的GAS菌株MLST分型的详细信息见表1。
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讨论病原菌的分型方法是流行病学研究中的重要方法。GAS常见的分型方法包括血清分型、分子分型和基因序列分型。M蛋白是常规GAS的血清学分类的基础。emm 分型是一种基于编码GAS成熟M蛋白基因高变区的核苷酸序列特异性的分型方法。与血清学分型方法相比，emm 分型更精确、快速，且可快速、轻松地通过互联网进行比较。但emm 分型无法揭示各菌株间的亲缘关系。MLST是一种基因序列分型技术，主要通过直接分析DNA中的7个看家基因核酸序列来定义。7个看家基因位点根据特定序列构成基因图谱，该序列决定了分离株的基因序列类型。该方法可用于比较同一菌属中的不同高毒力细胞系，将一个菌属与其他细菌属区分开来，并通过互联网可在全球范围内鉴定和跟踪细菌病原体和耐药性流行病菌株毒力因子的传播。当前，emm分型和MLST分型在全世界GAS分型的流行病学研究中被广泛使用。自1990年代以来，本团队一直致力于GAS的研究［10-11］。本课题组在2007年的研究表明，中国儿童猩红热由GAS克隆emm 1.00/ST28，st5240/ST28，emm 4.00/ST38，emm 12.00/ST36和emm 22.00/ST46引起［9］。然而，在2016年至2018年，emm 1.00/ST28、emm 4.00/ST39、emm 12.00/ST36、emm 22.00/ST46和emm 75.00/ST49共5个GAS克隆可导致中国儿童发生猩红热。10年前，emm 4.00克隆属于ST38，但现在其属于ST39。以前，致中国儿童猩红热GAS不包括emm 75.00/ST49克隆株，但目前，此克隆株出现在致中国儿童猩红热的致病菌株中。以上数据说明中国致儿童猩红热的GAS流行克隆群在2007年至2018年发生了变迁。近年来研究表明，在加拿大，emm 1.00、emm 28.00、emm 59.00和emm 12.00克隆群是导致2003年至2017年GAS感染的主要致病菌株，但在2017年GAS感染中，emm 1.00、emm 74.00、emm 101.00和emm 59.00克隆群占据了优势［12］。在日本，除了emm 1.00和emm 12.00两个克隆群外，emm 4.00克隆群常见于2007中期至2008年，emm 28.00和emm 89.00两个克隆群在2012年流行，而emm 3.00和emm 89.00两个克隆群流行于2018年［13］。本研究结论与上述加拿大及日本学者的研究结果相同，支持某一区域内的GAS流行克隆群会随着时间推移而发生变迁。既往研究表明，emm 1.00型GAS克隆群与波兰的肺炎和深部软组织感染有关，可在欧洲造成非侵袭性及侵袭性GAS感染，在北美可引起侵袭性GAS感染［14-16］。emm 12.00/ST36型GAS是澳大利亚儿童猩红热的暴发流行的致病克隆群［17］。本研究显示，2016年至2018年中国emm 1.00/ST28及其亚型GAS可引起儿童蜂窝织炎、脓疱病和猩红热，emm 12.00/ST36及其亚型GAS与儿童脓毒症、咽扁桃体炎、支气管炎、肺炎及猩红热发病有关，emm 4.00/ST39是儿童猩红热及OSAS的致病菌株。这些研究数据表明，每种GAS克隆群在同一地区可导致多种不同疾病，GAS克隆群与其致病谱之间存在地域相关性。既往研究显示，emm 1.00/ST28和emm 12.00/ST36两个克隆是导致美国儿童颅内GAS感染的主要菌株［18］。在全球范围内，emm 49.00、emm 60.00和 emm 55.00 三个克隆群持续引起急性链球菌性肾小球肾炎发生［19］。2016年至2018年，导致中国儿童GAS感染的菌株共由emm 1.00/ST28、emm 4.00/ST39、emm 12.00/ST36、emm 22.00/ST46、emm 28.00/ST52、emm 75.00/ST49和emm 89.00/ST921七个克隆群构成。其中，OSAS 由emm 4.00/ST39、emm 12.00/ST36和emm 89.00/ST921菌株引起；支气管炎的致病克隆群包括emm 12.66/ST36和emm 89.00/ST921菌株；emm 12.19/ST36和emm 22.00/ST46克隆群可导致儿童过敏性紫癜发生。这些研究表明，同一地区、同一时期GAS的多个克隆群可引起同一种疾病。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
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