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作者：张雯婷1 闫竞宇2 壮文军3 姜春红4 屠文娟3通信作者：屠文娟，Email：tuwenjuan2008@163.com作者单位：1南通大学附属常州儿童医院药学部，常州 213003；2中国科学院大连化学物理研究所分析化学分离科学重点实验室，大连 116023；3南通大学附属常州儿童医院新生儿科，常州 213003；4南通大学医学院研究生院，南通 226000本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(5):371-376.引用本文：张雯婷,闫竞宇,壮文军,等.双唾液酸乳糖-N-四糖改善肠道代谢微环境稳态抑制新生大鼠坏死性小肠结肠炎病理进程[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(5):371-376.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20200821-01392.
摘要
目的 探讨双唾液酸乳糖-N-四糖（DSLNT）对坏死性小肠结肠炎（NEC）新生大鼠肠道内容物低分子量代谢谱的影响，探索其对新生儿肠道的保护作用方式。方法 新生SD大鼠按随机数表法随机分为对照组、NEC组和NEC+DSLNT组，大鼠均采用特殊配方奶人工喂养，NEC组和NEC+DSLNT组以3次/d的频率进行缺氧（950 mL/L 氮气，10 min）/冷刺激（4 ℃，10 min）、连续3 d诱导新生大鼠NEC模型，NEC+DSLNT组在特殊配方奶中添加300 μmol/L DSLNT。造模72 h时处死所有存活大鼠，采集回结肠部位肠内容物进行基于超高效液相色谱-组合型四级杆Orbitrap质谱仪(UHPLC-QE-MS)的非靶向代谢组检测，末端回肠行苏木精-伊红染色。代谢组数据用SIMCA 14.1软件进行多元变量统计分析。以正交偏最小二乘分析（OPLS-DA）模型的变量投影重要度（VIP）值>1和t检验中P<0.05筛选两两比较的组间差异代谢物。结果 DSLNT降低NEC发生率和NEC大鼠回肠组织病理学评分［3.0(2.0,3.0）分 比 1.0（1.0,2.0）分,P<0.01］，并可有效抑制炎症浸润。基于UHPLC-QE-MS代谢组检测结果建立的OPLS-DA模型能较好地对NEC组和对照组、NEC+DSLNT组和NEC组实现分离。NEC组和对照组之间有64个差异代谢物（OPLS-DA模型的VIP值>1且 P<0.05），包括二十二碳六烯酸（+288.0%，P=0.028）、黄嘌呤（+372.1%，P=0.007）、L-精氨酸（+233.1%，P=0.027）、L-亮氨酸（+232.7%，P=0.015）、N-乙酰神经氨酸（-41.6%，P=0.014）等，这些代谢物可映射到34条不同的代谢通路，其中精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢等6条代谢通路为NEC主要扰动的代谢通路。NEC+DSLNT组与NEC组之间存在15种差异代谢物，包括D-甘露糖（-73.5%，P=0.032）、黄嘌呤（-63.4%，P=0.008）、亚油酸（+137.9%，P=0.047）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（+278.2%，P=0.005）等，这些差异代谢物可映射到7条代谢通路，其中亚油酸代谢为DSLNT主要影响的差异代谢通路。两种比对策略中重合的差异代谢物数量为8个，其在NEC中的变化趋势在DSLNT给药组中均出现显著逆转。结论 DSLNT能显著缓解缺氧/冷刺激造成的新生大鼠NEC病理损伤，该保护作用与其改善NEC造成的肠内容物代谢谱偏移、调节亚油酸代谢通路有关。DSLNT的早期预防性补充对维护新生儿肠道稳态、预防NEC病理进程具有重要意义。
关键词
坏死性小肠结肠炎；代谢组学；人乳寡糖；双唾液酸乳糖-N-四糖
坏死性小肠结肠炎（NEC）是常见于早产儿的消化道危重症，在<32周的极低出生体质量儿中发病率为3%~10%，相关死亡率高达20%~30%［1］。目前，NEC发病机制依旧不明，有效的药学防治策略亦未出现［2］。人乳寡糖（HMOs）是人乳中的第三大宏量营养物质，其在人乳中含量高达5~20 g/L，百倍于其他哺乳动物乳汁，且多样性极强，结构多为人类独有。HMOs既不被人体消化道酶所降解，也不在小肠被大量吸收，因此大部分HMOs可以以完整的结构形式到达小肠末端和结肠发挥生物学活性［3-4］。最新临床前和临床研究进展表明，HMOs中一种特定寡糖单体双唾液酸乳糖-N-四糖（DSLNT）是人乳防治NEC的核心成分［5-7］，但目前对DSLNT对新生肠道的保护机制知之甚少。肠内容物代谢(物)组是肠道生物体所有的基因和蛋白质活动的终末产物，能即时、灵敏地被动反映肠道的应答和整体状态，也可主动对肠上皮的能量代谢和黏膜免疫系统起到关键的调节作用［8］。因此，本研究拟采用基于超高效液相色谱-组合型四级杆Orbitrap质谱仪（UHPLC-QE-MS）的检测方式结合代谢组学的研究手段探索DSLNT对NEC大鼠肠道代谢微环境的影响，筛选该寡糖单体作用条件下的标志性变化代谢物和代谢通路，以考察DSLNT对新生肠道的保护机制。
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材料与方法1.1 实验材料和动物1.1.1 实验主要试剂和材料 PreNAN低出生体质量婴儿营养配方奶粉（瑞士Nestle公司），ESBILAC初生犬特殊配方奶粉（美国PetAg公司），DSLNT由中国科学院大连化学物理研究所分离分析化学重点实验室提供，质谱级甲醇、乙腈、甲酸和乙酸铵（德国CNW Technologies公司），L-2-氯苯丙氨酸（恒柏生物科技有限公司，中国上海），一次性静脉留置针（24 G×19 mm/Z-G，威海洁瑞医用制品有限公司）。1.1.2 实验主要仪器设备 1290 Infinity超高效液相色谱系统（美国Agilent公司），ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（美国Waters公司），Q-Exactive组合型四极杆Orbitrap 质谱仪（美国Thermo Scientific公司）。1.1.3 实验动物及分组 无特定病原体（SPF）清洁级SD大鼠38只（1日龄，雌雄不限），由南通大学动物实验中心提供［许可证号：SCXK(苏)2014-0001］。所有新生大鼠按随机数字表法随机分为3组：对照组（8只）、NEC组（15只）和NEC+DSLNT组（15只）。本研究经南通大学附属常州儿童医院医学伦理委员会审批通过［批准文号：常儿医伦理审查（科研）20180022］。1.2 方法1.2.1 NEC动物模型制备 所有新生大鼠饲养于自制饲养箱中（箱内温度20~25 ℃；湿度60%~65%），均采用特殊配方奶（15 g preNAN早产儿奶粉加入75 mL ESBILAC 初生犬用奶粉中配制而成）经去芯留置针经口插管进行人工喂养，奶量为0.2 mL/顿，3顿/d。NEC+DSLNT组大鼠用添加了DSLNT（300 μmol/L）的特殊配方奶喂养。NEC模型依据文献［7］建立并稍作调整：用缺氧［950 mL/L氮气（N2），10 min］+冷刺激（4 ℃，10 min），3次/d，间隔7~9 h重复1次，连续3 d建立新生大鼠NEC模型；平行的对照组不做特殊处理。1.2.2 大鼠肠内容物获取 制模72 h后处死所有存活大鼠，用4 ℃预冷的磷酸盐缓冲液（PBS） 0.5 mL对回结肠肠段进行灌洗得到肠内容物，并立即放入液氮中淬灭待进行代谢组学检测；取末端回肠1 cm放入多聚甲醛固定液中固定，待行组织病理学检查。1.2.3 肠组织病理学损伤评级 多聚甲醛中固定的末端回肠样本经石蜡包埋、切片后进行苏木精-伊红（HE）染色，并进行病理学损伤评级［9］”。病理评级≥2分为NEC阳性标准。1.2.4 基于UHPLC-QE-MS方法的非靶向代谢组检测和数据处理 （1）代谢物提取：肠内容物冻干处理后加入含内标L-2-氯苯丙氨酸（1 mg/L）的提取液（甲醇∶乙腈∶水=2∶2∶1）600 μL进行代谢物提取，并将样本置于-20 ℃冷却1 h后进行离心（12 000 r/min，离心半径 8.6 cm,15 min），取上清进样。（2）色谱条件：用1290 Infinity UHPLC色谱仪配合ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100.0 mm，1.8 μm）进行代谢物分离/定量，进样体积3 μL。流动相组成：正离子（ESI+）模式，1 mL/L” 甲酸水溶液（流动相A）；乙腈（流动相B）；负离子（ESI-）模式，5 mmol/L乙酸铵水溶液（流动相A）；乙腈（流动相B）。梯度洗脱程序：0 min，1% B；1 min，1% B；8 min，99% B；10 min，99% B；10.1 min，1% B；12 min，1% B。流速 0.5 mL/min。（3）质谱条件：鞘气（N2）流速45 Arb，辅气流速15 Arb，毛细管温度320 ℃，碰撞能量20/40/60 eV，扫描速率7 Hz，电喷雾电压3.8 kV（ESI+模式）和－3.1 kV（ESI-模式），质荷比范围70~1 000。（4）数据处理：质谱数据用ProteoWizard软件转换为mzML格式，用XCMS进行保留时间校正、峰识别、峰提取峰积分以及峰对齐，并用OSI-SMMS软件version 1.0配合自检数据库完成物质鉴定。1.3 统计学处理 大鼠回肠组织病理学评分用中位数（四分位数）表示，以Mann-Whitney秩和检验（GraphPad Prism 8.0）进行组间比较,P<0.05为差异有统计学意义。肠内容物代谢物数据用SIMCA 14.1软件进行分析，以正交偏最小二乘分析（OPLS-DA）模型的score plot将组间差异可视化，并用置换检验对样本的稳健性进行验证，以变量投影重要度（VIP）反映代谢物对组间差异的贡献度。将同时满足OPLS-DA模型中VIP>1和t检验中 P<0.05作为组间差异代谢物的筛选条件；用MeV软件对差异代谢物进行层次聚类（HCL）分析；使用MetaboAnalyst 4.0在线分析软件对每个对比策略中所有差异代谢物进行富集分析和拓扑分析，将富集分析-ln(P)>3.0且拓扑分析 impact>0.1的代谢通路筛选为显著差异代谢通路。
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结果2.1 大鼠肠组织形态学染色 实验终点（制模72 h）时，对照组大鼠全部存活，NEC组大鼠存活率为73.3%（11/15只），NEC+DLSNT组存活率86.6%（13/15只）；组织形态学染色结果（图1A）显示，对照组大鼠回肠末端组织结构完整；NEC组大鼠回肠黏膜层受到显著破坏，从黏膜层到浆膜层均出现不同程度损伤甚至穿孔，大量炎性颗粒细胞浸润；NEC+DSLNT组大鼠回肠受损表现主要为黏膜层上皮细胞的部分脱失，罕见黏膜下层、肌层甚至浆膜层的累及。组织病理学评分结果（图1B）表明，NEC+DSLNT组病理评分为1.0（1.0,2.0）分，显著低于NEC组［3.0（2.0,3.0)分,U=12,P<0.01］，表明DSLNT对缺氧/冷刺激造成的新生大鼠肠道NEC损伤有显著的保护作用。
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讨论探索NEC的防治药学防治途径、提高新生生命存活率是亟待解决的医学任务。HMOs的前期研究展示了DSLNT在防治NEC方面的潜质［6-7,10］，但其对新生肠道的保护作用方式鲜有报道。肠内容物代谢谱中多种物质，如短链脂肪酸、胆汁酸、色氨酸及其肠道代谢物已经明确具有调节肠道稳态和肠道免疫系统响应的作用［11］。因此，肠道代谢紊乱是多种炎症性肠病的重要特征和致病风险因素［12］，改善和维持肠道代谢环境稳态是重要的防治方案开发策略。在NEC疾病状态下，随着肠上皮屏障的破坏和病情的快速进展，上皮细胞碎片、黏膜固有层免疫细胞产物、来自血管炎性渗漏的低相对分子质量循环代谢物等均可进入肠腔，因此肠内容物代谢谱可能发生较大偏移，继而影响进一步破坏肠道功能和稳态，导致病情迅速进展。在本研究中，非靶向代谢组学研究结果证实NEC新生大鼠肠道内容物代谢谱与对照组存在显著区别，以氨基酸（AAs）、有机酸（OAs）蓄积为重要特征，这与肠道炎症时肠上皮细胞吸收功能障碍、肠道微生物组成和丰度改变及其相关的AAs/OAs利用模式改变有关［13-16］。配方奶中添加母乳生理浓度（300 μmol/L）的DSLNT可显著缓解新生大鼠因缺氧/冷刺激造成的肠道组织病理学损伤，使损伤和炎症细胞浸润主要局限在黏膜层，而不拓展到黏膜下层、肌层和浆膜层。与此同时，64个NEC病理状态下筛选出的差异代谢物中，60个在DSLNT给药后变化趋势出现逆转，其中8个有统计学意义，表明DSLNT可维持肠道内环境稳态、抑制新生大鼠肠道代谢紊乱。NEC标志性的AAs和OAs蓄积在DLSNT 组得到显著缓解，这可能与DSLNT帮助维持肠上皮组织结构和功能完整性、改善肠上皮对腔内营养物质吸收有关。由于AAs的摄入和利用是驱动T淋巴细胞活化的关键调节因素［17］，同时肠道中，菌群的稳态、肠上皮细胞的生长及线粒体功能、细胞间紧密连接的形成与稳定，甚至杯状细胞的数量和黏蛋白分泌能力均与AAs供给和细胞内向摄取AAs有关［18］。因此可以推测DSLNT减少AAs在肠道的蓄积可以改善NEC病理条件下肠道T淋巴细胞的异常活化并抑制此后的炎症反应，同时缓解因AAs模块失稳态造成的肠道功能紊乱，这与本研究中所观测到的DSLNT改善NEC大鼠肠黏膜炎症细胞聚集、增加肠道黏膜结构完整性相一致。此外，本研究发现DSLNT显著提高NEC大鼠肠内容物中PGD2的含量。PGD2具有良好的抗炎活性，其在动物模型中已被证实可有效抑制溃疡性结肠炎［19］、慢性过敏性气道炎症［20］及关节炎症［21］，因此DSLNT对NEC的改善作用亦可能与其对PGD2的上调作用有关。京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库比对结果及通路分析表明DSLNT对亚油酸代谢通路有最为显著的影响。据报道，亚油酸具有广泛的生物学功能，其可抑制小胶质细胞中由饱和脂肪酸引起的炎症反应，从而对小胶质细胞活化造成的脑部炎症有潜在抑制作用［22］；另有研究表明，具有抗炎作用的脂质介质组织再生保护缀合物1（PCTR-1）可通过调节亚油酸代谢抑制脂多糖（LPS）导致的促炎细胞因子的释放和氧化应激失衡［23］。亚油酸在NEC病理进程中的作用和角色尚未见相关报道，但本研究结果提示亚油酸及其代谢通路可能与NEC病理进程相关，且有可能是DSLNT发挥保护作用的关键靶标。本研究从代谢组学的宏观角度考察了DLSNT对肠道微环境的保护作用，但其对特定代谢物（如亚油酸、PGD2）及其生物学功能的作用和作用方式值得进一步进行分子机制探索。综上所述，本研究通过观察DSLNT对NEC大鼠肠内容物代谢轮廓的影响，揭示DSLNT显著逆转NEC造成的肠道代谢谱偏移，尤其对亚油酸代谢通路有显著的调节作用，从而稳定肠道代谢微环境、抑制新生大鼠NEC病理进程。该研究为阐释DSLNT对新生肠道的保护作用和作用方式提供了有利依据，并提示DSLNT的早期预防性补充对维持肠道代谢环境稳态、预防NEC具有极为积极的作用。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
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