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作者：林威 林蓓蓓 唐震海 梁亚峰 潘国权通信作者：潘国权，Email：81801800@163.com作者单位：温州医科大学附属第二医院、育英儿童医院儿童重症与急诊医学科，温州 325000本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(3):210-213.引用本文：林威,林蓓蓓,唐震海,等.宏基因组二代测序技术协助诊断3例无焦痂儿童恙虫病[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(3):210-213.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20200628-01071.
摘要
目的 对3例无焦痂恙虫病患儿的病原宏基因组二代测序技术(mNGS)检测结果进行分析，探讨其在临床的应用价值。方法 回顾性分析。2018年6月至2019年10月温州医科大学附属第二医院、育英儿童医院收治的3例重症无焦痂儿童恙虫病的临床资料，2例为5岁男童，1例为6岁女童。3例患儿的外周血均进行mNGS检测。结果 3例患儿经mNGS检测后均提示恙虫病东方体感染，且未并其他病原感染。例1死亡，例2和例3治愈出院。结论 无焦痂恙虫病患儿早期诊断困难。对于临床感染性疾病，特别是早期无法确诊的疑难危重性感染性疾病，mNGS能够提供快速准确的病原学诊断支持，为精准治疗提供帮助。
关键词
恙虫病；焦痂；病原；宏基因组二代测序技术；儿童
恙虫病是由恙虫病东方体感染引起的急性自然疫源性疾病［1］。恙虫病的临床表现复杂多变，典型的初发症状为恙螨叮咬部位的水泡性病变，随后变成焦痂伴局部淋巴结病变，严重者可导致多器官衰竭,甚至死亡［2］。儿童恙虫病患者越来越常见，但儿童患者临床表现有时不典型，特别是病程中未出现皮肤焦痂的患儿，早期临床诊断非常困难。近年来，随着基因测序方法的发展，基于宏基因组二代测序技术（metagenomics next-generation sequencing,mNGS）在疾病诊断中发挥了良好的作用［3］。目前国内外尚未见mNGS技术在儿童恙虫病患者中使用的报道。现对3例温州医科大学附属第二医院、育英儿童医院儿童重症监护室收治的无焦痂儿童恙虫病患者进行mNGS检测，结合患儿临床资料进行综合分析，探讨mNGS在儿童恙虫病诊断中的应用价值。
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资料与方法1.1 临床资料 回顾性分析2018年6月至2019年10月温州医科大学附属第二医院、育英儿童医院儿童重症监护室收治的3例疑难危重症患儿的临床资料。本研究通过医院医学伦理委员会批准（批准文号：LCKY2020-364），患儿监护人均知情同意。例1，男，5岁，于2018年6月以发热1周为主诉入院。入院前1周患儿每天反复发热，体温波动于38~40 ℃（耳温），偶有咳嗽和腹痛，无其他不适，在当地卫生院给予“头孢类抗生素”治疗6 d，“地塞米松针”治疗3 d后，体温仍反复。入院查体：呼吸促，约55次/min，经皮血氧饱和度0.95左右，双眼睑水肿，双侧颈部可触及较多淋巴结，最大约1.0 cm×1.0 cm，质软，活动度可，无触痛，肝脾肋下1 cm，质软边锐，双肺呼吸音粗，可闻及湿啰音，全身未见皮疹和焦痂。辅助检查：白细胞计数(WBC) 8.60×109/L，血红蛋白(Hb) 94 g/L，血小板计数(PLT) 48×109/L；C反应蛋白（CRP） 64.49 mg/L；降钙素原（PCT）1.640 μg/L；血清铁蛋白（SF） 748.8 μg/L；谷丙转氨酶（ALT） 106 IU/L，白蛋白（ALB） 31.3 g/L；三酰甘油（TRIG） 3.93 mmol/L，总胆固醇（CHOL） 2.01 mmol/L，高密度脂蛋白胆固醇（HDL） 0.31 mmol/L，低密度脂蛋白胆固醇（LDL） 0.61 mmol/L；纤维蛋白原（FIB） 2.86 g/L，D二聚体（DDSG） 11.52 mg/L；痰液细菌培养、呼吸道病毒抗原检测、EB病毒抗体检测、外斐式反应、非典型肺炎抗体检测均阴性；胸片提示两肺渗出性改变，左侧胸腔少量积液；腹部超声提示肝大伴回声改变，胆囊壁水肿；骨髓常规提示淋巴细胞增生，可见2.5%异型淋巴细胞，单核样组织细胞占1%，单核细胞大致正常，噬血细胞易见。入院诊断：噬血细胞综合征；肺炎。入院后予头孢哌酮舒巴坦针抗感染，丙种球蛋白针封闭抗体，地塞米松针抗炎，依托泊苷针化疗及必要对症支持治疗后，患儿病情持续进展，出现呼吸衰竭和休克。入院后第5天采集外周血标本送南京华大基因公司行mNGS病原体核酸检测。例2，女，6岁，于2018年7月以发热9 d为主诉入院。入院前9 d患儿每天反复发热，体温波动于38~40 ℃（耳温），在外院先后予“头孢唑肟针、头孢曲松针、更昔洛韦针”治疗7 d后，体温仍反复，并出现低血压。入院查体：呼吸42次/min，血压 87/35 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，经皮血氧饱和度0.93，双眼睑水肿，双侧颈部可触及数颗肿大淋巴结，最大约1.0 cm×1.5 cm，质中，活动度可，无触痛，咽充血，扁桃体 Ⅱ度，两肺呼吸音稍粗，肝脾肋下2 cm，质中边锐，无触痛，全身未见皮疹和焦痂。辅助检查：血常规：WBC 3.90×109/L，Hb 93 g/L，PLT 53×109/L；CRP 87.48 mg/L；PCT 1.430 μg/L；SF 1 258.5 μg/L；ALT 151 U/L，ALB 32.8 g/L；TRIG 2.20 mmol/L，CHOL 1.84 mmol/L，HDL 0.18 mmol/L，LDL 0.53 mmol/L；FIB 2.15 g/L，DDSG>20 mg/L；痰液细菌培养、呼吸道病毒抗原检测、EB病毒抗体检测、外斐式反应、非典型肺炎抗体检测均阴性；胸片提示两肺广泛渗出改变。腹部超声提示肝肋下2 cm，脾肋下2.7 cm,胆囊壁增厚；骨髓常规报告提示淋巴细胞比例正常，幼稚淋巴细胞偶见，异性淋巴细胞偶见，噬血细胞易见，网状细胞可见。入院诊断：噬血细胞综合征；脓毒性休克；肺炎。入院后予美罗培南针、万古霉素针抗感染、地塞米松针抗炎、丙种球蛋白针免疫治疗及必要对症治疗1 d后，患儿仍反复高热，并出现胸闷、咯血、呼吸衰竭及意识不清。入院后第2天采集外周血标本送华大基因公司行mNGS病原体核酸检测。 例3，男，5岁，于2019年10月以发热、呕吐7 d，腹痛1 d为主诉入院。入院前7 d患儿出现反复发热，体温波动于38.0~39.5 ℃（耳温），伴呕吐，量不多，每日7~8次，多为胃内容物，在当地医院予头孢美唑针抗感染，间断激素及补液支持治疗5 d后，患儿仍有反复发热，呕吐较前减少。1 d前出现阵发性上腹部疼痛，来院查腹腔B超示“一过性肠套叠”，予开塞露排便后，腹痛好转。入院查体：面色、口唇稍苍白，肝肋下1 cm，质软边锐，脾肋下未触及，全身未见皮疹和焦痂。辅助检查：血常规：WBC 11.52×109/L，Hb 109 g/L，PLT 37×109/L；CRP 97.76 mg/L，PCT 14.13 μg/L；SF >1 500.0 μg/L；ALT 149 IU/L，ALB 27.4 g/L；TRIG 2.39 mmol/L，CHOL 1.45 mmol/L，HDL 0.16 mmol/L，LDL 0.22 mmol/L；FIB 1.64 g/L，DDSG>20 mg/L；急诊查淀粉酶 104 IU/L；痰液细菌培养、呼吸道病毒抗原检测、EB病毒抗体检测、外斐式反应均阴性；骨髓常规报告提示淋巴细胞比例大致正常，异型淋巴细胞多见（占2.5%），单核细胞易见，部分可见空泡变性，吞噬细胞（部分可见噬血）、组织细胞易见（占1.5%）。腹部超声提示肝周积液，脾周积液，腹腔积液；胸片提示两肺纹理增粗。入院诊断：脓毒症；肠套叠（一过性）；急性胃炎。入院当天予头孢哌酮舒巴坦针抗感染及对症支持治疗。入院后1 d患儿出现休克，予采集外周血标本送华大基因公司行mNGS病原体核酸检测。1.2 方法 1.2.1 外周血样本处理和DNA提取（华大基因公司） 血液样本将采血管2 000×g离心10 min后取0.6 mL血浆，再16 000×g高速离心10 min,取300 μL血浆，使用微量样品基因组DNA提取试剂盒 (DP316,北京天根生化科技有限公司)，根据试剂盒说明书提取DNA。提取的DNA用作DNA文库构建［4］。1.2.2 文库构建和测序 使用Agilent 2100 Bioanalyzer质控文库插入片段大小，使用Qubit dsDNA HS 检测试剂盒 (赛默飞世尔科技公司)质控DNA文库浓度，经环化形成単链环形结构。环化后的文库经滚环复制（RCA）生成DNA纳米球。制备好的DNA纳米球加载到测序芯片，使用BGISEQ-50/MGISEQ-200/MGISEQ-2000进行测序［5］。1.2.3 数据分析 测序数据下机后去除低质量的和长度小于35 bp 的数据以获得高质量的数据。通过Burrows-Wheeler-Alignment（BWA:http://bio-bwa.sourceforge.net/）比对,将高质量数据中比对上人参考基因组序列的数据去除［6］。剩下的数据在去除低复杂度序列数（reads）后与专用细菌、真菌、病毒、寄生虫4个微生物大数据库比对，获得能够匹配到某种病原体的序列数，根据序列数的高低及临床其他检测判断可能的病原体。
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结果例1外周血mNGS检测结果为恙虫病东方体感染，严格匹配核酸序列数为1 725条（表1），基因覆盖率为10.60%（图1A），结果回报前患儿因多脏器衰竭死亡。例2外周血mNGS检测结果为恙虫病东方体感染，严格匹配核酸序列数为10条（表1），基因覆盖率为0.09%（图1B），先后给予阿奇霉素、氯霉素抗感染后，患儿临床症状逐渐好转，最终治愈出院。例3外周血mNGS检测结果为恙虫病东方体感染，严格匹配核酸序列数为1 925条（表1），基因覆盖率为4.42%（图1C），先后给予阿奇霉素、氯霉素抗感染后，患儿临床症状逐渐好转，最终治愈出院。
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讨论焦痂是恙虫病典型的皮肤改变，也是该病早期临床诊断的重要依据和线索［7］。在明确的流行病学背景下，持续发热和多系统受累的儿童无痛性皮肤焦痂往往提示患有恙虫病［8］。颈部、躯干、腹股沟、腋窝和腘窝是焦痂最常见的受累部位［2,9］。由于焦痂无痛、无痒，且多在皮肤褶皱处，易漏诊。一些研究表明，儿童恙虫病患者中，焦痂阳性率为7%~97%［10-11］。与成人不同，男性患儿的焦痂阳性率高于女性患儿［12］，这可能与男性患儿户外活动更多，更容易接触草坪、灌木等恙虫栖息地有关。值得注意的是临床中部分恙虫病患儿在整个病程期间都不出现特异性的皮肤焦痂。由于非特异性症状往往延误诊治，导致恙虫病发病率和死亡率增高［13］。本研究3例患儿病程中均未出现皮肤焦痂，入院后病原学检测阴性，2例初步诊断噬血细胞综合征伴感染，1例初步诊断为脓毒症，对症处理及广谱抗生素治疗效果差。说明无典型皮肤焦痂改变和有效的实验室诊断方法对临床表现不典型的恙虫病早期诊断十分困难。目前我国诊断恙虫病的实验室方法主要基于血清学和分子生物学实验，近11年实验室确诊比例仅为4.7%［14］。间接免疫荧光试验（IFA）是诊断恙虫病的金标准［15］，但其相对昂贵，需要训练有素的检测人员和专业的设备［16］。酶联免疫吸附试验显示出良好的敏感性和特异性，但易受到标本采集时间和质量的影响［17］。最便宜和最容易获得的血清学试验是外斐式试验，但特异性和敏感性均较低［18］。聚合酶链反应（PCR）和实时定量PCR等分子诊断方法具有良好的敏感性和特异性，但易受到抗生素使用的影响［19］。病原体培养难度大，需要专业的人员和实验中心，不易开展［10］。mNGS是一个开放的分析和诊断系统，可直接通过对临床样品中的核酸进行高通量测序，然后与数据库进行比对分析，客观地检测出临床标本中的病原微生物核酸序列（包括病毒、细菌、真菌、寄生虫等）。目前mNGS可检测8 000多种病原体,检测序列不需要特异性扩增，且不受抗生素使用的影响，具有高度的特异性和敏感性，尤其适用于急危重症和疑难感染的诊断［3,20］。本研究3例患儿病情重，入院后病情进展快，而传统检测方法未能确诊病原，通过mNGS检测后均确诊为恙虫病，且3例病例在已使用过多种抗生素后仍能检测出恙虫病东方体核酸序列，即使例2仅有10个核酸片段亦能检出。Wang等［21］认为mNGS将成为检测和控制感染的有效工具，能为优化患者的抗生素治疗提供有价值的信息。此外，本研究3例患儿mNGS检测结果显示未合并其他病原体感染，相较于传统检测方法只能进行意向性筛查，而无法做到病原体检查广覆盖，mNGS可一次性、短时间地排除或识别其他病原体的感染，为医师提供更全面的患者感染谱信息，为临床诊断和早期治疗争取时间。综上所述，无焦痂恙虫病患儿早期诊断困难。对于临床感染性疾病，特别是早期无法确诊的疑难危重性感染性疾病，mNGS能够提供快速准确的病原学诊断支持，为精准治疗提供帮助。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
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