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作者：张其刚1 侍学琴2 周冲2通信作者：侍学琴,Email:jsycsxq2013@sina.com作者单位：1淮安市妇幼保健院基因检测技术应用示范中心,淮安 223002；2盐城市妇幼保健院儿童内分泌遗传代谢门诊,盐城 224002本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(3):213-215.引用本文：张其刚,侍学琴,周冲.3-甲基戊烯二酸尿症 Ⅰ 型患儿1例AUH基因新变异分析[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(3):213-215.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20200710-01155.
摘要
目的 探讨3-甲基戊烯二酸尿症(MGA)Ⅰ型患儿的致病变异。方法 回顾性分析。采用高通量测序结合Sanger测序验证对2017年6月盐城市妇幼保健院收治1例Ⅰ型MGA患儿家系进行基因检测，运用生物信息学方法对新变异的致病性进行预测，并对新剪切变异的可能影响进行实验验证。结果 血串联质谱、尿气相色谱质谱结果提示患儿为Ⅰ型MGA。患儿AUH基因检出复合杂合变异c.373C>T(p.R125W)和c.942+3A>G，分别来自母亲和父亲；3种软件预测错义变异c.373C>T (p.R125W)具有致病性，R125在各物种中高度保守；4种在线分析工具预测新变异c.942+3A>G不影响剪切，但反转录-PCR联合Sanger测序分析表明,该变异引起AUH基因转录产物第9外显子缺失。患儿出生45 d起予左卡尼汀及无亮氨酸奶粉治疗，体格智力发育正常。结论 若患儿临床诊断明确，针对临床意义不明变异需进行RNA分析，验证其对剪切的影响；本研究丰富了AUH基因的突变谱。
关键词
3-甲基戊烯二酸尿症Ⅰ型；高通量测序；AUH基因；新变异
3-甲基戊烯二酸尿症(3-methylglutaconic aciduria,MGA)按致病基因可分为 Ⅰ~Ⅵ 型，Ⅰ 型 (MIM#250950)是由AUH基因编码的3-甲基戊二酰辅酶A水合酶(3-methylglutaconyl-CoA hydratase,3-MGH)缺陷引起的罕见常染色体隐性遗传病［1-3］。Ⅰ 型MGA临床表型呈异质性，最常见的临床特征为儿童期全面发育迟缓或智力障碍以及成人期缓慢起病的进行性脑白质病［4］。我国暂未见 Ⅰ 型MGA病例的报道，本研究对2017年6月盐城市妇幼保健院收治1例经新生儿遗传代谢病串联质谱(tandem mass spectrometry，MS/MS)筛查发现血3-羟基异戊酰肉碱(3-hydroxy-isovalerylcarnitine，C5-OH)明显增高的患儿进行复查、基因检测、变异分析及随访，以期为同类疾病的诊治提供参考。
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资料与方法1.1 研究对象 回顾性研究。患儿，女，系第1胎,第1产，孕39周剖宫产娩出，出生体质量3 500 g。其父母体健，非近亲结婚，否认家族遗传病病史。患儿出生4 d采足跟血经MS/MS筛查发现C5-OH水平增高,为1.69 μmol/L(参考值0.08~0.51 μmol/L)，复查结果为1.43 μmol/L，尿气相色谱质谱检测发现3-甲基戊烯二酸(3-MGA)和3-羟基异戊酸(3-HIVA)显著升高，3-甲基戊二酸(3-MG)轻度升高。结合血MS/MS和尿气相色谱质谱结果，患儿高度疑似 Ⅰ 型MGA。患儿就诊时无异常，于出生45 d予左卡尼汀及无亮氨酸奶粉治疗，定期复查血尿MS/MS及体格检查，血尿指标较新生儿期无显著改变，患儿现3岁，生长发育正常。本研究通过医院医学伦理委员会批准（批准文号：LW2020001）。1.2 方法 1.2.1 基因检测 经患儿监护人签署知情同意书后，采用高通量测序技术对患儿进行基因检测。采集患儿及父母外周血各2 mL，提取基因组DNA。应用常见有机酸脂肪酸代谢异常套组捕获试剂盒，靶向富集患儿的目标基因全部外显子及其侧翼序列进行高通量平行测序。检出可疑变异后，采用Sanger测序在家系中进行验证。采用Primer 5软件设计验证引物，引物由上海生工生物公司合成，扩增AUH基因第3外显子的引物序列：正向5′-TTCTCTGAATGCCTTGCTCACTC-3′，反向5′-ACAGACAAAGAGGAGTTGTTGGT-3′，长度450 bp；扩增AUH基因第9内含子的引物序列：正向5′-GGGTGCTTTGGGGATAAGGTT-3′，反向5′-CACGCTCATCACCACTCTCC-3′，长度492 bp。家系PCR扩增产物送上海生工生物公司进行Sanger测序，应用Mutation Surveror软件分析测序结果。1.2.2 剪切变异预测及验证 应用在线分析工具HSF (http://www.umd.be/HSF3/)， BDGP (http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html)，NetGene2 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/)和ASSP (http://wangcomputing.com/assp/)预测新剪切变异对AUH基因转录的可能影响。采集患儿父亲2.5 mL外周血保存于PAXgene Blood RNA Tubes(BD，美国)中，提取总RNA反转录为cDNA。根据AUH基因的cDNA序列，采用软件Primer 5设计引物验证新剪切变异的可能影响。PCR扩增产物跨越外显子7-3′UTR，812-1 145位，引物序列：正向5′-ACAGAACCAGGAGGGAGACG-3′，反向5′-GGTTCCATGTGCTGAGGCAT -3′，扩增产物长334 bp。PCR扩增产物经Sanger测序后比对UCSC数据库中AUH基因的cDNA参考序列。1.2.3 错义变异的生物信息学分析 采用在线分析工具PROVEAN、MutationTaster、PolyPhen-2预测新错义变异的致病性；采用在线工具COBALT(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/cobalt.cgi?CMD=Web)比对分析变异氨基酸及其两侧序列的同源性；采用在线软件HOPE(http://www.cmbi.ru.nl/hope/)分析新错义变异对蛋白二级结构和三级结构的影响。
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结果2.1 基因检测 患儿AUH基因检出复合杂合变异，分别是位于第3外显子的c.373C>T(p.R125W)和第9内含子的剪切变异c.942+3A>G。c.373C>T (p.R125W)在数据库GnomAD 中的频率为0.000 008 (2/251 350)，其中亚洲人共49 004个等位基因无此变异；在数据库HGMD、1000Genomes、ExAC中未见该变异收录。c.942+3A>G在上述数据库中均未见收录。c.942+3A>G为新变异，c.373C>T (p.R125W)为亚裔人群中首次发现的新变异。Sanger测序验证复合杂合变异c.373C>T (p.R125W)和c.942+3A>G分别来自母亲和父亲(图1~2)。
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讨论Wortmann等［2］于2013年将MGA重新分类为原发性和继发性，前者(即 Ⅰ 型)由AUH基因突变引起的3-MGH缺陷所致，后者包括磷脂重塑缺陷、线粒体膜相关疾病和原因不明的MGA共3类。MGA的临床诊断以尿中3-MGA持续排泄增加为主要特征，若3-HIVA也增高，且3-MGA/3-MG>20，则考虑为原发性；若3-HIVA正常，3-MGA/3-MG<20，则考虑为继发性［2］。原发性MGA患者血C5-OH水平显著增高［4］；继发性MGA患者该指标可正常［5］。由于多种代谢性疾病可导致血C5-OH升高，临床需联合尿气相色谱质谱检测进行鉴别［6-8］。本例患儿血MS/MS和尿气相色谱质谱结果与既往研究［2，4］一致。AU结合蛋白(AUH)具有RNA结合和亮氨酸分解代谢水合酶双重功能［9-10］。AUH位于线粒体内膜和基质，与线粒体核糖体结合并调节蛋白质合成，对线粒体生成、形态、功能及RNA代谢具有重要作用［10］。人AUH由339个氨基酸残基组成，其中 1-67位氨基酸为转运肽序列，68-339位为主链。本研究在患儿AUH基因检出的新复合杂合变异，其影响位置均位于主链。有研究表明，Lys109-Ile128共20位氨基酸的缺失可降低80％以上AUH与RNA的结合力；若125位的野生型精氨酸被替代为谷氨酸，则结合力显著降低。此外，AUH的水合酶活性需要完整的三维构象，68位氨基酸下游的大多数变异都会降低酶的活性［9］。上述研究表明，125位氨基酸对于维持AUH的双重功能不可或缺。本研究中，变异R125W在亚洲人数据库中未见收录，R125在不同物种中高度保守，多种软件预测变异R125W具有致病性；二/三级结构分析野生型和变异型氨基酸差异大，变异型会导致原有的氢键和盐桥破坏。这提示，变异 c.373C>T(p.R125W)具有致病性，但危害程度还需进一步分析。本研究验证了另1个新变异c.942+3A>G引起AUH基因转录产物第9外显子丢失，产生C端缺失16个氨基酸残基的截短蛋白，提示该变异具有致病性。然而，4种在线剪切预测软件均预测失败。这表明，对于软件预测不影响剪切的临床意义不明变异(VUSs)，也需进行RNA分析，可为临床诊断提供更多依据。Ha等［11］对257个变异进行了外周血RNA分析，结果表明剪切分析能阐明部分VUSs的功能，提高临床诊断率。由于外周血易获得，且遗传代谢病相关基因在外周血中表达，因此RNA分析应作为该类疾病诊断VUSs的常规方法。我国暂未见原发性MGA病例的报道。Ⅰ 型MGA临床表型差异大，即使基因型相同表型也会存在差异。Illsinger等［12］报道1例4岁患儿，12月龄时出现发热相关的癫痫发作，但精神运动发育正常。有学者报道了一对姐弟携带相同的AUH基因1-3号外显子纯合缺失变异，14岁的姐姐具有学习障碍、注意缺陷多动障碍和早发性亚临床脑白质病，而9岁的弟弟仅语言发育迟缓［4］。本例患儿体格智力发育正常，暂无临床表现，表明新生儿期的筛查及防治可减轻或避免原发性MGA产生的危害。综上，本研究丰富了AUH基因的突变谱，明确了 Ⅰ 型MGA患儿的受累病因，为临床治疗及家系再生育的产前诊断提供了依据，也为同类疾病的诊断提供了参考。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
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