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作者：王娟梅1 何少茹2 张爱民1 李云1通信作者：何少茹，Email:hsr1605@126.com作者单位：1湖南省人民医院（湖南师范大学附属第一医院）儿科，儿童呼吸病学湖南省重点实验室，长沙 410000；2广东省人民医院/广东省医学科学院儿科，广州 510080本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(13):1017-1022.引用本文：王娟梅,何少茹,张爱民,等.4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶对间歇缺氧早产大鼠肺损伤的保护作用[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(13):1017-1022.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20210520-00563.
摘要
目的 了解4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶（Tempol）对低体积分数给氧干预下间歇缺氧早产大鼠肺组织缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）的表达及肺发育的影响。方法 建立给氧间歇缺氧模型。于孕21 d估计胎鼠临产剖宫取鼠，存活早产大鼠192只按照随机数字表法分为6组：空气对照+盐水组、空气对照+Tempol组、恒定给氧+盐水组、恒定给氧+Tempol组、给氧间歇缺氧+盐水组、给氧间歇缺氧+Tempol组，每组32只。于出生7、14、21 d，每组各取8只采用化学分析法检测早产大鼠肺组织丙二醛（MDA）、总抗氧化能力（TAOC），采用实时荧光定量PCR（qPCR）和免疫组织化学法分别检测HIF-1α和VEGF的mRNA 和蛋白水平；每组另取8只21 d大鼠行肺功能检测。多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK-q检验。结果 给氧间歇缺氧+盐水组较恒定给氧+盐水组早产鼠出现轻度肺间隔增厚，MDA增加，TAOC下降，VEGF、HIF-1α mRNA和蛋白表达上升，肺功能指数下降，差异均有统计学意义(均P<0.05)；给氧间歇缺氧+Tempol组较相应盐水组MDA下降、TAOC上升［14 d MDA(3.09±0.45） nmol/(mg·pr)比(4.02±0.30) nmol/(mg·pr)、TAOC(3.13±0.31) U/(mg·pr)比(2.44±0.22) U/(mg·pr)，21 d MDA(2.87±0.43) nmol/(mg·pr)比(4.47±0.56) nmol/(mg·pr)、TAOC(3.47±0.35) U/(mg·pr)比(2.31±0.32) U/(mg·pr)］，差异均有统计学意义(均P<0.05)；给氧间歇缺氧+Tempol组较相应盐水组，HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表达下降，于14 d HIF-1α mRNA(2.11±0.60比2.88±0.59)下降的差异有统计学意义(P<0.05)，肺功能指数潮气量［(0.41±0.01） mL比(0.36±0.02) mL］、每分钟呼吸通气量［(35.48±2.95) mL比(30.62±2.27) mL］、最大呼气流量［(2.19±0.19) mL/s 比(1.51±0.19) mL/s］、动态肺顺应性［(2.65±0.40) mL/cmH2O比(1.83±0.34) mL/cmH2O,1 cmH2O=0.098 kPa ］均增加（均P<0.05）。结论 Tempol可减轻低体积分数给氧干预下间歇缺氧所致的早产大鼠氧化应激肺损伤，并改善其肺功能。
关键词
早产；大鼠；肺发育；间歇缺氧；缺氧诱导因子-1α；血管内皮生长因子
临床上，母体患有妊娠高血压综合征、糖尿病以及胎盘功能异常等因素可能导致胎儿早产［1-2］。早产儿有更多机会暴露于机械通气、高体积分数氧及炎症损伤等，而其本身抗氧化酶生成不足［3］，易造成氧化应激损伤［4］，最终诱发机体出现支气管肺发育不良（BPD）［5-6］。虽目前主张低体积分数给氧，多认为<300 mL/L氧体积分数对肺损伤小，但临床工作中呼吸暂停、气管堵塞、感染等均可导致早产儿给氧治疗下的一过性缺氧［7］，而缺氧-复氧可产生大量氧自由基，造成体内氧化与抗氧化失衡，从而导致细胞缺氧-复氧损伤［8］。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是细胞适应缺氧的关键因子，而血管内皮生长因子（VEGF）调节肺血管发育。4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶（Tempol）是超氧化物歧化酶（SOD）的拟似物，能高效清除氧自由基。本研究分析Tempol对低体积分数给氧干预下间歇缺氧肺发育的影响，旨在为Tempol可减少间歇缺氧肺损伤提供理论依据。
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材料与方法1.1 材料 无特定病原体孕15 d SD大鼠购自长沙天勤生物科技有限公司，动物许可证号：scxk(湘)2014-0010。anti-VEGF、anti-HIF-1α、二抗山羊抗兔IgG购自英国Abcam公司；Tempol购自美国selleckchem公司；丙二醛（MDA）检测试剂盒、总抗氧化能力（TAOC）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。1.2 方法1.2.1 实验分组及动物模型的建立 孕15 d SD大鼠12只，适应性饲养。于孕21 d，每2 h密切观察，如活动减少，腹部不对称隆起等，估计胎鼠入盆临产行剖宫产［9］。存活的192只早产大鼠按照随机数字表法分为6组：空气对照+盐水组、空气对照+Tempol组、恒定给氧+盐水组、恒定给氧+Tempol组、给氧间歇缺氧+盐水组、给氧间歇缺氧+Tempol组，每组32只。于出生第1、2、3天予Tempol（100 mg/kg）或等量9 g/L盐水腹腔注射［10］。给氧间歇缺氧模型建立［11］：将近期分娩代乳鼠及早产鼠置有机玻璃箱内，内置钠石灰及无水氯化钙吸收二氧化碳(CO2)及水分。向箱内通入氧气或氮气，使舱内氧体积分数维持在(300±10) mL/L，后下降至(100±10) mL/L，维持2 min后再升至(300±10) mL/L，10 min后降至(100±10) mL/L，如此循环3次，每6 h循环3次，每0.5 h测量箱内氧体积分数1次。恒定给氧组300 mL/L持续给氧。早产大鼠给氧治疗14 d后，置常温常压空气中至21 d。定时互换各组间的代乳鼠。1.2.2 标本收集与处理 各组于出生7、14、21 d各取8只早产鼠称重后麻醉，放血处死，取左肺行HE染色、免疫组织化学测定，右肺行HIF-1α、VEGF mRNA表达检测。1.2.3 MDA、TAOC测定 采用化学分析法分别检测肺组织中MDA及TAOC。1.2.4 实时荧光定量PCR（qPCR）检测肺组织HIF-1α、VEGF mRNA 表达 Trizol提取肺组织总RNA。反转录后，行qPCR检测。引物（南京金斯瑞生物科技有限公司）：VEGF引物分别为5′-TGTGAGCCTTGTTCAGAGCG-3′和5′-GACGGTGACGATGGTGGTGT-3′。HIF-1α引物分别为5′-TGCTTGGTGCTGATTTGTGA-3′和5′-GGTCAGATGATCAGAGTCCA-3′。β-actin引物分别为5′-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3′和5′-TAGGAGCCA-GGGCAGTAATCT-3′。1.2.5 免疫组织化学方法检测肺组织HIF-1α、VEGF蛋白表达 切片抗原修复，过氧化氢灭活内源性酶，加HIF-1α、VEGF兔抗大鼠IgG，4 ℃孵育，滴加生物素标记的山羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min，二氨基联苯胺显色，复染，封片，镜下观察。HIF-1α结果判定：胞质内有棕黄色细颗粒沉着为阳性细胞；VEGF结果判定：胞质中有棕黄色颗粒沉着为阳性细胞。蛋白表达的半定量分析：每个标本随机抽取1张切片，每组共8张，计算每高倍镜视野下100个细胞中的阳性细胞数，取平均值。1.2.6 肺功能检测 于出生后21 d，另取各组早产大鼠8只，麻醉后切开气管，插管，连接BuxCo小动物肺功能实验平台系统，检测早产大鼠的潮气量（TV）、每分钟呼吸通气量（MV）、最大呼气流量（PIF）及动态肺顺应性（Cdyn）等指标，了解早产大鼠在其呼吸过程中肺弹性所发生的变化。1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料以x̄±s表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
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结果2.1 各组早产大鼠肺组织病理学改变 随日龄增加，各组大鼠肺组织终末气腔变小，数量增多，进行性肺泡化。恒定给氧组肺泡结构清晰，大小较均一，肺泡间隔正常，无液体和炎症渗出；空气对照组可见轻度肺间隔增厚；给氧间歇缺氧组肺间隔增厚稍明显，肺泡腔内可见少许红细胞渗出，肺泡结构稍紊乱。给氧间歇缺氧+Tempol组较相应盐水组肺间隔增厚减轻，肺泡腔内红细胞渗出减少（图1）。
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讨论随着新生儿救治技术的不断提高，早产儿的存活率得到了显著提高。人类肺发育囊泡期为孕25~35周，SD大鼠肺与人类胎肺发育阶段类似，其囊泡期为孕 21 d至出生后3 d，因此选近足月的早产SD大鼠适合用于早产儿肺发育研究。早产儿出生后较足月儿更多处于机械通气、高体积分数氧以及炎症损伤等状态［12］。正常状态下，氧化与抗氧化系统处于平衡，内源性抗氧化酶，如SOD可清除氧自由基，保护细胞免受损伤［13］。当机体抗氧化系统能力减弱时，大量氧自由基无法及时清除，从而攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化，导致脂质过氧化物，如MDA的产生。胎肺抗氧化酶在妊娠周期末10%~15%显著增长。早产儿未达到该发育时期，因此其肺抗氧化剂储备不够，抗氧化能力受损。有报道表明，机体内产生的自由基、脂质过氧化代谢产物等毒性物质由高体积分数氧引起，使肺组织形成氧化应激损伤，并最终诱发机体出现BPD［14］。因此近年来早产儿BPD的发病率逐年上升。在实际临床工作中，呼吸暂停、感染等均可导致早产儿在给氧治疗下发生一过性缺氧，而缺氧-复氧可产生并释放大量氧自由基，而早产儿抗氧化能力弱，氧自由基不能及时清除而造成细胞损伤。本课题组前期研究显示，间歇缺氧导致早产大鼠肺TAOC降低，肺组织出现不良的组织病理形态，导致早产大鼠肺功能显著降低［15］。Tempol可清除自由基，抑制脂质过氧化，其效果约为SOD的106倍。El-Sayed等［10］研究显示，Tempol可通过减少肺组织肿瘤坏死因子-α、白细胞介素1β和γ干扰素水平等减轻脂多糖诱导的急性肺损伤［9］。Wang等［16］研究表明Tempol通过抑制炎症和氧化应激可减轻阻塞性睡眠呼吸暂停所致慢性间歇缺氧引起的肺损伤。故本研究选用Tempol干预，旨在减轻给氧间歇缺氧所致氧化应激肺损伤。研究表明，HIF-1α/VEGF信号通路在胚胎和胎儿出生后肺发育以及血管生成中发挥重要作用［17］。蓝国锋等［18］研究发现，布地奈德可通过降低炎症反应及上调VEGF表达，促进肺组织血管重塑，增加肺组织微血管密度的方式缓解BPD新生大鼠肺组织病理变化。Tibboel等［19］研究表明，肺上皮组织HIF-1α的表达通过上调VEGF与出生后血管生长增加有关。然而，在远端肺中稳定的HIF-1α表达并不能预防高氧所致的新生儿肺损伤，反而使肺功能恶化。因此，正常水平的HIF-1α和VEGF表达对肺发育是必要的，异常表达会导致肺损伤。本研究结果显示，给氧间歇缺氧+盐水组较相应恒定给氧组出生后不同时间点早产大鼠肺组织MDA明显增加，而TAOC降低，HIF-1α、VEGF的mRNA明显升高，且出现轻度肺间隔增厚，肺泡腔内可见少许红细胞渗出，肺泡结构稍紊乱，肺功能指数明显下降，表明持续低体积分数给氧干预下间歇缺氧同样存在氧化应激损伤，可导致HIF-1α/VEGF过表达，影响肺发育。另外，本研究发现，空气对照组较恒定给氧组MDA升高、TAOC下降，肺组织间隔稍增厚，虽无明显统计学意义，考虑早产鼠生后亦一定程度上需给氧治疗。Di Fiore等［20］研究显示，极早早产儿早期氧气吸入和间歇性低氧事件发生与2岁时喘息增加有关，本研究结果或与该临床观察研究结果存在相同间歇缺氧肺损伤机制。本研究结果显示，予Tempol干预的给氧间歇缺氧组较相应盐水组于14 d、21 d MDA明显下降，TAOC明显升高，HIF-1α、VEGF表达下降，虽多无统计学差异，但肺间隔增厚减轻，肺泡腔内红细胞渗出减少，肺功能指数明显上升。综上，在早产大鼠持续低体积分数给氧过程中，间歇缺氧会出现脂质过氧化增加，降低其抗氧化能力，出现HIF-1α/VEGF信号通路调节异常，影响肺发育。Tempol能在一定程度上上调给氧间歇缺氧所降低的TAOC，改善其肺功能，对预防和治疗间歇缺氧对肺发育造成的不良影响有一定积极作用，具体作用机制还有待进一步研究。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
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