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作者：段博阳1 王月2 杨李2 刘乐2 崔珍珍2 余莉3 唐久来2 吴德1通信作者：吴德，Email：845177603@qq.com作者单位：1安徽医科大学第四附属医院儿科，合肥 230000；2安徽医科大学第一附属医院儿科，合肥 230000；3病原生物学安徽重点实验室，合肥 230000本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(13):1011-1016.引用本文：段博阳,王月,杨李,等.基于“多重打击”理论建立SD大鼠认知功能障碍模型及相关机制研究[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(13):1011-1016.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20220101-00002.
摘要
目的 通过脑发育早期脂多糖（LPS）重复刺激，建立SD大鼠认知障碍模型，探讨炎症反应介导下的“多重打击”对其组织学、行为学的影响及相关的分子机制。方法 本研究的实验设计类型为成组设计。通过腹腔注射LPS构建SD大鼠“多重打击”认知障碍模型，将24只孕鼠按照随机数字表法分为对照组、LPS1组、LPS2组、LPS3组，每组6只。对照组孕18 d孕鼠和20日龄仔鼠均腹腔注射9 g/L盐水；LPS1组孕18 d孕鼠腹腔注射9 g/L盐水；LPS2组孕18 d孕鼠腹腔注射0.05 mg/kg LPS；LPS3组孕18 d孕鼠注射0.1 mg/kg LPS。LPS1~3组仔鼠均在20日龄时腹腔注射1 mg/kg LPS。通过前肢悬吊、网格和水迷宫等行为学实验，对仔鼠运动和认知功能进行整体评估。组织学和蛋白免疫印迹（WB）实验检测仔鼠脑组织中胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、Notch1和Jagged1的相对表达量。采用单因素方差分析进行多组数据之间比较，采用独立样本t检验进行2组数据之间比较。结果 1.行为学实验：与对照组比较，LPS1~3组仔鼠的前肢悬吊时间递减［（34.81±5.66） s、（22.47±4.35） s、（13.20±4.25） s 比（43.88 ± 4.85） s］，网格实验中足踏空次数递增（16.13±2.90、20.75±3.10、25.13±4.45比9.00±2.72），差异均有统计学意义（F=69.77、35.59，均P<0.001）；Morris水迷宫实验中的潜伏期时间和总路程呈递增趋势（P<0.05）。2.WB实验：与对照组比较，LPS1~3组GFAP、Notch1、Jagged1蛋白的相对表达量显著增加（P<0.05）。3.苏木精-伊红（HE）染色和电镜病理：与对照组比较，LPS1~3组仔鼠额叶皮质组织结构排列松散，细胞固缩明显。电镜下细胞质不同程度水肿、线粒体嵴断裂、部分核膜破损。结论 在“多重打击”认知障碍模型中，仔鼠脑组织的损伤和行为学的改变，可能与LPS重复暴露介导的Notch1/Jagged1通路上调有关。
关键词
脑组织；脂多糖；认知障碍；星形胶质细胞；胶质纤维酸性蛋白；Notch1/Jagged1信号通路；SD大鼠
认知障碍是儿童期严重阻碍身心健康发展的一种常见临床症状，也是脑性瘫痪、孤独症谱系障碍和智力障碍等神经发育障碍性疾病常见的合并症之一。尤其是存在发育早期脑损伤的儿童，反复慢性感染、严重过敏反应等，会引发认知障碍的出现［1-2］。如何阻断认知障碍的发生是临床的一大难题。有学者认为，早产、炎症、宫内生长受限等均可能是对发育中大脑的首次“打击”，发育期的感染和免疫刺激，将会对新生儿脑发育造成双重或“多重打击”，“多重打击”可能是阻断神经损伤修复，导致严重认知障碍等后遗症的主要机制之一［3-5］。本实验拟建立脑发育早期脂多糖（LPS）重复刺激的“多重打击”导致认知障碍的SD大鼠模型，应用行为学、蛋白免疫印迹（WB）和组织病理学等探究其发病机制，寻找阻断认知障碍的药物靶点。
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材料与方法1.1 实验动物饲养 健康清洁级孕13 d SD大鼠24只，体质量 （290±20） g［SCXK（浙）2019-001］。SD孕鼠饲养于实验动物中心，周围环境保持12 h光照/12 h黑暗、适宜温度（24±2） ℃和相对湿度（55±5）%。本研究通过安徽医科大学实验动物伦理委员会审批（伦理批号：LLSC20220172）。1.2 动物模型建立 本实验模拟脑发育早期反复炎症刺激，构建SD大鼠LPS介导的“多重打击”模型［6-7］，实验设计如下：（1）对照组孕鼠孕18 d和仔鼠出生后20 d腹腔注射9 g/L盐水。（2）LPS1组孕鼠孕18 d腹腔注射9 g/L盐水。（3）LPS2组孕鼠孕18 d腹腔注射0.05 mg/kg LPS。（4）LPS3组孕鼠孕18 d腹腔注射0.1 mg/kg LPS。（5）LPS1~3组仔鼠均在20日龄时腹腔注射1 mg/kg LPS。1.3 相关指标的检测1.3.1 大鼠行为学实验1.3.1.1 前肢悬吊实验 前肢悬吊实验主要评价仔鼠前肢近端肌力和抓握功能［8］，将仔鼠前肢放于直径为0.5 cm的水平玻璃棒上，保持仔鼠完全离地约50 cm，记录每只仔鼠保持完全悬空状态到落地前的时间。1.3.1.2 网格实验 网格实验［8］是将仔鼠放置于2 m×1 m的铁制金属网格上，每个小格之间的距离为3 cm，记录5 min内每只仔鼠在自由运动时足踏空的次数，重复实验3次。1.3.1.3 Morris水迷宫实验 Morris水迷宫实验主要用于评估动物空间分辨和学习记忆力的能力［6］，分为学习和测试2个阶段，第1-3天为仔鼠的适应性学习阶段，目标平台隐藏于第三象限距离水面3 cm处，从圆形池壁四个起始点（四个象限）的任意一个象限将仔鼠放入水中。若在最大潜伏期时间60 s内仍未找到平台，可进行适当引导。每天在固定时间学习3次，随着学习时间和次数增加，仔鼠在逐渐以较短的时间找到目标平台。连续3 d的学习结束后进行第4-9天的测试实验，当日成绩为3次实验的平均值。1.3.2 WB实验 完成行为学测试后的仔鼠（约40日龄），依次腹腔注射100 g/L水合氯醛溶液诱导麻醉后，在冰上快速取出脑组织（保存于-80 ℃冰箱中）。加入适量蛋白裂解液，经充分研磨后，脑组织匀浆以12 000 r/min离心15 min（离心半径10 cm）。上清液加入上样蛋白缓冲液，在99 ℃金属浴中煮10 min至蛋白变性，保存于-80 ℃冰箱中。各组样品依次经过电泳、转膜、封闭、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜等操作，在显影仪中曝光并保存。1.3.3 苏木精-伊红（HE）染色 同上述方法取出脑组织后，放于40 g/L多聚甲醛溶液中固定2 d，组织块包埋、切片后，依次经过二甲苯、乙醇溶液中脱水脱蜡，洗涤，苏木精溶液染色后洗涤，依次经过盐酸-酒精、稀碳酸锂水溶液，再经过伊红染色液染色后，最后经乙醇溶液调色脱水后封片。1.3.4 免疫组织化学染色 同上述方法取脑、包埋、切片后，依次经过二甲苯、乙醇溶液梯度脱蜡、脱水，再经过内源性过氧化物酶阻断、抗原修复、磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤、一抗孵育、PBS洗涤、二抗孵育、二氨基联苯胺（DAB）显色。在显微镜下观察是否出现特异性染色，用蒸馏水终止反应。苏木精染液复染，流水冲洗数秒，室温自然晾干后，中性树脂封片。1.3.5 电镜切片制备 仔鼠经100 g/L水合氯醛溶液麻醉后，充分暴露手术区域，多聚甲醛-戊二醛溶液经心脏灌注后取脑，切取额叶皮质1 mm大小的组织块，放于多聚甲醛-戊二醛固定液中。经漂洗、固定、梯度脱水、包埋、切片，在电镜下观察并摄片。1.4 统计学处理 应用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计量资料用x̄±s表示。仔鼠24 h内死亡率通过χ2检验进行分析，行为学、WB和组织化学染色实验结果通过Graphpad prism 8软件分析处理，并采用两独立样本t检验和单因素方差分析进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。
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结果2.1 孕鼠和仔鼠给药后情况 给药后24 h内，对照组、LPS1组、LPS2组孕鼠活动自如、进食饮水基本正常；LPS3组孕鼠死亡1只，组内其余5只孕鼠一般情况尚可。4组新生仔鼠数量分别为79、75、62、47只，4组仔鼠在24 h内死亡数量分别为2、4、7、11只。与对照组比较，LPS1组仔鼠死亡率差异无统计学意义（χ2=0.25，P>0.05），LPS2组和LPS3组仔鼠死亡率明显增高，差异均有统计学意义（χ2=3.89、10.85，均P<0.05）（表1）。
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讨论本实验通过脑发育早期LPS重复刺激建立“多重打击”动物模型，研究发现：LPS1~3组仔鼠在行为学实验中前肢悬吊时间减少、足踏空次数明显增加，表明存在运动功能障碍；水迷宫实验中潜伏期时间延长、总路程增多以及电镜下脑组织超微结构受损严重，提示与认知功能密切相关的大脑皮质受损。WB和免疫组织化学染色实验结果提示：GFAP、Notch1、Jagged1相对表达量均存在显著性增加。推测仔鼠脑组织病理损伤、运动和认知功能障碍可能与Notch1/Jagged1信号通路的过度激活有关。相关研究表明，发育期脑损伤的危险因素主要分为三类：（1）宫内因素：宫内感染、宫内生长受限和胎盘血管疾病；（2）产时因素：出生窒息、绒毛膜羊膜炎和胎盘早剥；（3）产后因素：新生儿败血症和脑室内出血等［9-10］。其中，炎症反应作为脑损伤的独立危险因素，通过发育早期免疫系统的激活，调节Notch通路等生长发育相关信号通路的表达，进而影响神经发生、胶质细胞分化和突触重塑等过程［11-13］。在中枢神经系统中，星形胶质细胞的数量丰富、分布广泛，对维持正常的神经功能至关重要，如电解质平衡、血脑屏障的完整性以及谷氨酸的稳态［14］。在内外界环境的刺激下，细胞的结构和功能也会发生相应免疫学改变，包括胞体肥大和GFAP表达增加，活化成为反应性星形胶质细胞［15］，促进炎症介质和细胞因子的释放，放大“瀑布式”炎症效应。有研究发现［16-17］，LPS诱导多种炎症因子的高表达，改变周围微环境，可能通过IL-1β激活Notch通路，不仅影响神经前体细胞的增殖和分化，降低突触传递效率，还会干扰海马的正常功能。本研究构建的“多重打击”动物模型，不仅在行为学上观察到仔鼠运动和认知功能存在不同程度的障碍，而且在组织学、分子学实验中检测出GFAP、Notch1和Jagged1表达量的显著性增加。推测在LPS的重复刺激下，放大了中枢免疫失衡的下游效应，过度激活了Notch1/Jagged1信号，可能抑制海马区的神经发生，导致仔鼠长期学习记忆能力的缺陷。本研究模拟婴幼儿期脑损伤的高危因素（反复炎症刺激）和病理类型，为认知障碍性疾病的精准治疗提供了新靶点。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
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