点击蓝字 关注我们
作者：杨中华1 宋翠萍2 张海洋2 饶旺2 邵秋平1 原志庆3通信作者：宋翠萍，Email：scp1965@163．com作者单位：1新乡医学院第一临床学院，卫辉 453100；2新乡医学院第一附属医院小儿外科， 卫辉 453100；3新乡医学院， 新乡 453003本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(23):1813-1817.引用本文：杨中华,宋翠萍,张海洋,等.乙烯利暴露对青春期雄性SD大鼠精子质量的影响[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(23):1813-1817.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20220316-00277.
摘要
目的 探讨乙烯利暴露对青春期雄性SD大鼠精子质量的影响及机制。方法 选取45日龄雄性SD大鼠40只，按照随机数字表法分为对照组和低、中、高剂量实验组，每组10只，分别给予9 g/L 盐水溶液和100 mg／kg、200 mg／kg、400 mg／kg的乙烯利水溶液连续灌胃28 d。取一侧附睾尾制备精子混悬液，检测精子浓度及活力；取睾丸、附睾组织行ＨＥ染色，光镜下观察睾丸、附睾组织病理形态变化；检测附睾超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，丙二醛（MDA）水平；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测附睾α-葡萄糖苷酶活性、左旋肉碱（LC）水平、核转录因子E-2相关因子（Nrf2)及肉碱转运蛋白（OCTN2)表达水平，以评估乙烯利对附睾的氧化损伤。采用SPSS 26.0软件进行分析，多组间比较采用单因素方差分析，2组间均数比较采用LSD法。结果 对照组、低、中、高剂量组精子浓度分别为（40.21±1.94）×109/L、（35.23±2.53） ×109/L、（23.61±2.62）×109/L、（18.86±2.16）×109 /L；活动率分别为（70.98±3.01）%、（57.96±3.75）%、（45.71±2.41）%、（31.23±2.26）%；实验组大鼠附睾精子浓度及活力均明显低于对照组(均 P<0.01)；对照组，低、中、高剂量组SOD活性:（46.48±2.21） U/mg prot、（38.49±2.56） U/mg prot、（33.80±1.73） U/mg prot、（27.65±2.05） U/mg prot；GSH-Px活性:（21.41±1.95） U/mg prot、（17.32±1.28） U/mg prot、（15.09±0.94） U/mg prot、（14.08±1.23） U/mg prot；MDA水平:（1.41±0.09） nmol/mg prot、（1.59±0.09） nmol/mg prot、（1.81±0.09） nmol/mg prot、（2.16±0.14） nmol/mg prot；实验组SOD和GSH-Px酶活性均明显低于对照组(均 P<0.05)，而MDA水平则明显高于对照组(P<0.05)。对照组、低、中、高剂量组α-葡萄糖苷酶水平分别为（15.46±0.71） U/mL prot、（12.95±0.72） U/mL prot、（11.34±0.65） U/mL prot、（8.76±0.60） U/mL prot;LC分别为（6.21±0.31） μg/L、（5.89±0.13） μg/L、（5.02±0.12） μg/L、（4.38±0.07） μg/L，与对照组比较，实验组α-葡萄糖苷酶、LC浓度均明显下降(均 P<0.01)；对照组和低、中、高剂量组附睾Nrf2的表达水平分别为（1.34±0.05） ng/L、（1.25±0.04） ng/L、（1.08±0.06） ng/L、（0.92±0.04） ng/L，OCTN2的表达水平分别为（4.55±0.12） ng/L、（4.23±0.11） ng/L、（3.20±0.24） ng/L、（2.59±0.05） ng/L，与对照组比较，实验组Nrf2、OCTN2表达水平均明显下降(均P<0.01)。结论 乙烯利暴露使大鼠生殖器官产生过量活性氧，发生氧化应激，可能通过激活Keap1-Nrf2/ARE信号通路，使其精子数量减少，活力降低，精子质量下降，导致生育能力受损。
关键词
乙烯利；氧化应激；精子质量
乙烯利(2-氯乙基膦酸）作为一种有机磷催熟剂，广泛用于缩短农作物栽培时间并加速成熟过程［1］，过量使用导致其于果蔬表面残留,误食会影响机体的健康［2］。研究发现乙烯利通过增强活性氧(ROS)产生并增强细胞中的脂质过氧化作用［3］，本课题组前期研究表明，乙烯利可促进生精细胞凋亡，有一定生殖毒性［4］。但关于乙烯利致大鼠少弱精子症的研究尚不多见，因此，本研究使青春期雄性SD大鼠暴露于不同浓度乙烯利溶液，观察大鼠睾丸和附睾组织病理结构变化、检测附睾氧化应激和能量代谢水平的变化，探讨乙烯利暴露对大鼠精子质量的影响及可能的发生机制。
1
材料与方法1.1 材料 40只健康无特定病原体（SPF）级雄性45日龄SD大鼠，体重（200±10） g，购自邳州市东方养殖有限公司［许可证号：SCXK（苏）2017-0003］，饲养于清洁级动物实验中心。主要试剂及器材；乙烯利（江苏安邦电化有限责任公司，批号：PD84125-3）；超氧化物歧化酶(SOD)（优选，YX-071223P）、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)（优选，YX-071441P）、大鼠α-葡萄糖苷酶(优选，YX-071221P)、丙二醛（MDA）（优选，YX-071152P）、左旋肉碱（LC）（优选，YX-001203）及核转录因子E-2相关因子（Nrf2）（优选，YX-141806R）和肉碱转运蛋白（OCTN2）（优选，YX-150320R）检测试剂盒；日本OLYMPUS显微镜，奥地利Anthos 2010 酶标仪等。1.2 实验分组 雄性SD大鼠按照随机数字表法分为对照组和低、中、高剂量实验组，每组10只。分别给予9 g/L盐水和100 mg／kg、200 mg／kg、400 mg／kg的乙烯利水溶液；经口灌胃，1次/d，每日根据大鼠体重计算给药量，连续28 d。该实验由新乡医学院第一附属医院医学伦理委员会批准（批准文号：2019026）。1.3 睾丸、附睾、精囊脏器指数及精子质量检测 大鼠末次给药24 h 后称重，水合氯醛(0.7 mL/100 g)麻醉处死，取睾丸、附睾组织称重，计算睾丸、附睾脏器指数。取左侧附睾尾，置于1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）的试管中并剪碎，37 ℃孵育。吸取混悬液10 μL，按1∶100比例用PBS液稀释，加样至血球计数板的计数池中，用光学显微镜观察并计数精子，计数至少5个高倍镜下视野的精子数(评估不少于200个精子)，根据精子活力分为3 级，分别为前向运动、非前向运动、不活动。1.4 睾丸、附睾组织ＨＥ染色 取左侧睾丸、附睾放入多聚甲醛溶液，依次脱水固定、浸蜡、石蜡包埋，HE染色后置于显微镜下观察。1.5 附睾组织匀浆制备及生化检测 取0.1~0.2 g组织块于冷的9 g/L盐水洗净并吸干水分，在冰冷的 PBS 中匀浆，得到1∶9（重量/体积）匀浆。在4 ℃下以14 000 g 离心10 min，上清液在-80 ℃下冷冻保存。用酶标仪检测睾丸SOD、GSH-Px活性，MAD水平；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测附睾α-葡萄糖苷酶活性、LC水平、Nrf2及OCTN2表达水平。1.6 统计学处理 应用SPSS 26.0统计学软件进行分析，计量资料采用x̄±s表示，检验数据正态性及方差齐性，多组间比较采用单因素方差分析，2组间均数比较采用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。
2
结果2.1 大鼠生命体征观察 在实验过程中，高、中剂量组各有1只大鼠死亡。随着乙烯利灌胃时间延长，各实验组大鼠先后出现活动减少、毛发暗淡、反应迟钝症状。与对照组比较，中、高剂量组大鼠睾丸指数减小，差异有统计学意义(均 P<0.05)；与对照组比较，低、中剂量组大鼠附睾指数差异均无统计学意义( P>0.05)，高剂量组大鼠附睾指数明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)。结果见表1。
3
讨论当前不育症的发病率呈逐年升高趋势，全球约15%育龄夫妇婚后1年因不孕需干预性治疗［5］。男性不育症的影响因素很多，其中精子质量下降是导致不育症的最重要因素之一。研究显示，过量乙烯利可促进生精细胞凋亡，有一定生殖毒性［4］；国外有学者用 200 mg/kg 乙烯利造模，显示其可造成睾丸损伤，影响其生精功能［3］。目前乙烯利暴露对精子质量的影响及其潜在机制仍不十分清楚。大鼠的体重变化及睾丸、附睾指数可一定程度上反映大鼠及其生殖系统的损伤情况。本实验中，低剂量组大鼠体重增量较对照组无显著改变（P>0.05），中、高剂量组大鼠体重增量均明显减少(P<0.01)，有学者研究显示［4］，乙烯利对大鼠的消化系统有一定毒性，造成大鼠进食量减少，这可能是导致大鼠体重增量减少的原因。本研究结果显示，中、高剂量组大鼠的睾丸指数减小(均 P<0.05)，说明低剂量乙烯利对于睾丸的损伤不明显，剂量较大时损伤了大鼠睾丸，造成睾丸萎缩、重量减小。比较各组附睾指数，中、低剂量组附睾指数并无明显改变，而高剂量组附睾指数较对照组明显降低(P<0.01)。从大鼠的体重增量和脏器指数变化看，高剂量乙烯利对大鼠的一般状况及生殖系统损伤超过中、低剂量，且对睾丸、附睾损伤较大。精子质量的参数主要包括精子浓度、活力等，是评价机体生育能力的重要指标［6］。研究显示，生理状态下ROS的产生和清除处于动态平衡，过量ROS导致睾丸间质细胞、支持细胞、生精细胞等的凋亡，干扰精子的生成及成熟，使精子浓度及活力降低［7-9］。本研究显示，实验组大鼠睾丸的生精细胞减少且排列紊乱，生精小管间距增大，精子数目减少，这与杨治峰等［10］的研究结果一致。中、低剂量组大鼠附睾组织形态无明显改变，高剂量组附睾管间距增大，管腔变小；各剂量实验组大鼠附睾管中精子数目均明显减少，有较多非精子成分存在。GSH-Px使机体内过氧化物转化为低毒性的羟基化合物，防止ROS蓄积。MDA是脂质过氧化的终产物之一，可间接反映ROS水平和脂质过氧化损害的程度［11］。实验结果显示，超剂量乙烯利暴露可导致附睾SOD和GSH-Px活性降低，MDA水平显著增加，附睾中Nrf2表达显著下调，提高了大鼠附睾的ROS水平，影响精子的生成和成熟。Keapl-Nrf2/ARE是体内最重要的抗氧化信号通路之一，Nrf2作为其中的一员，是调节细胞氧化损伤的关键转录因子［12］；生理状态下，胞质内Nrf2呈非活性状态，发生氧化应激时，Nrf2转入细胞核内，激活靶基因表达［13-14］，调节下游多种靶蛋白的表达，使机体恢复氧化还原平衡状态。当Nrf2的激活发生障碍或缺失时，机体细胞氧化损伤加重，造成细胞功能障碍、凋亡甚至死亡［15-16］。实验结果显示乙烯利暴露导致附睾ROS水平明显升高，Nrf2表达水平明显下调，使精子数量减少。精子获能是精子受精的必要条件，在获能的基础上，精子活力才会增加，线粒体的能量代谢会影响精子的活力［17］。α-葡萄糖苷酶和LC是评价附睾功能的常用指标。目前普遍认为α-葡萄糖苷酶是附睾特异性酶，为精子运动提供能量，其活性高低可反映精液质量［18-19］。LC作为一种脂肪酸载体，转运脂肪酸至线粒体内，其缺乏与否直接影响线粒体内部脂肪酸氧化，对于精子成熟的具有十分重要的意义［20］。OCTN2是大鼠附睾最重要的LC转运蛋白，转运LC通过附睾上皮，使得脂肪酸的分解、氧化顺利完成。精子细胞膜上的多聚不饱和脂肪酸对ROS攻击十分敏感，当生殖系统ROS增多，会造成精子氧化损伤，干扰精子能量代谢，导致精子活力的降低［21］。实验结果显示，实验组大鼠附睾α-葡萄糖苷酶活性降低和LC水平下降，OCTN2表达水平下调，同时大鼠精子活力明显降低，表明过量乙烯利的暴露会干扰精子细胞能量代谢，影响精子获能，使精子的活力下降，且精子活力下降程度与乙烯利浓度呈一定的负相关。综上所述，超剂量乙烯利暴露使大鼠生殖器官产生过量ROS，导致其发生氧化应激，可能通过激活Keap1-Nrf2/ARE信号通路，使精子数量减少，活力降低，精子质量下降，导致大鼠生育能力受损。本研究为乙烯利的安全使用提供科学的实验数据，为青春期性发育及不育研究提供一定理论支持,当然本研究仅完成了动物实验，且样本量偏少，涵盖范围还不够广泛，关于乙烯利对精子质量影响的潜在机制的大样本研究仍有待于进一步完善，其对生育能力的影响值得进一步研究。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
点击“阅读原文”免费下载PDF全文