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作者：吴靖宜 陈丽植 应道静 庄宏杰 蒋小云通信作者：蒋小云，Email:jxiaoy@mail.sysu.edu.cn作者单位：中山大学附属第一医院小儿肾脏风湿病中心，广州 510080本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(24):1854-1860.引用本文：吴靖宜,陈丽植,应道静,等.NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎症小体在儿童抗中性粒细胞胞质抗体相关性血管炎中的作用[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(24):1854-1860.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20220601-00645.
摘要
目的 探讨NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体及其下游白细胞介素(IL)-1β、IL-6及IL-18在儿童抗中性粒细胞胞质抗体相关性血管炎(AAV)发病中的作用。方法 回顾性研究。采用免疫组织化学法检测中山大学附属第一医院小儿肾脏风湿病中心2003年9月至2020年9月诊断并行肾活检的22例原发性AAV患儿肾组织中NLRP3炎症小体的定位及表达。采用酶联免疫吸附试验检测血、尿IL-1β、IL-6、IL-18水平。正态分布计量资料两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素ANOVA检验；非正态分布计量资料比较采用Wilcoxon符号秩和检验；分类变量采用χ2检验；采用Pearson相关系数或Spearman秩相关系数分析变量间相关性。结果 NLRP3广泛表达于肾小管间质，且活动组的表达强度高于对照组，活动组肾小管和肾小球NLRP3半定量评分均高于对照组(F=0.859、8.320，均P<0.05)；活动组肾小管NLRP3半定量评分高于肾小球半定量评分(F=3.517，P<0.05)。活动组肾小管NLRP3半定量评分与肾活检时儿童血管炎活动度评分呈正相关(r=0.471，P=0.027)，与肾活检时估算肾小球滤过率呈负相关(r=-0.548，P=0.008)。活动组血IL-1β、IL-18及尿IL-6水平均高于缓解组和对照组(F=16.449、16.449、0.637、29.891、27.612、7.464，均P<0.05)，缓解组血IL-18水平高于对照组(F=18.671，P<0.05)。活动组血IL-1β水平与肾小管NLRP3半定量评分呈正相关(r=0.805，P=0.002)。活动组血IL-6水平与肾活检时C反应蛋白呈正相关(r=0.728，P=0.017)，尿IL-6水平与肾活检新月体比例呈正相关(r=0.677，P=0.032)。活动组血IL-18水平与肾小管NLRP3半定量评分、肾活检时儿童血管炎活动度评分及球性硬化比例呈正相关，与肾活检时估算肾小球滤过率值呈负相关(r=0.644、0.612、0.695、-0.577，均P<0.05)，尿IL-18水平与肾活检时补体C4水平呈正相关(r=0.855，P<0.05)。结论 NLRP3炎症小体及其下游IL-1β、IL-6、IL-18可能参与AAV的发病和进展，可作为疾病活动评估的参考指标之一。
关键词
抗中性粒细胞胞质抗体相关性血管炎；儿童；NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3；炎症小体
抗中性粒细胞胞质抗体相关性血管炎(antineutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis,AAV)是一种以血管炎症、内皮损伤和组织损伤为特征的疾病，其病因和发病机制尚未完全阐明［1-3］。活化的中性粒细胞主要通过中性粒细胞胞外捕获网(neutrophil extracellular traps，NET)、补体系统激活及细胞免疫调节等途径参与AAV的发病，而NET的形成作为中性粒细胞活化后最重要的杀菌方式之一，在AAV的发病中起至关重要的作用［4-7］。有研究表明［5,8-9］，在系统性红斑狼疮、2型糖尿病、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病中，NET中的蛋白质-DNA复合物通过刺激巨噬细胞中的NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3)炎症小体，切割白细胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-18前体，形成活化的IL-1β和IL-18，导致炎症疾病的加剧，但NLRP3是否参与AAV的发病目前仍不明确。Tashiro等［10］在28例成人AAV患者的肾组织发现IL-1β、NLRP3与肾小管间质的损伤程度相关。Wang等［11］在34例成人AAV患者的肾小球和肾小管间质中检测到NLRP3的表达增加。目前仅以上2篇文献报道了NLRP3炎症小体可能参与成人AAV的发病，尚未见儿童AAV相关研究。明确NLRP3炎症小体及其下游IL-1β、IL-6、IL-18与儿童AAV的发病及疾病活动间的关系，对AAV患儿未来的治疗或预后判断可能具有参考价值。因此，本研究通过检测AAV患儿肾组织中NLRP3炎症小体的表达，及其下游IL-1β、IL-6、IL-18在血清和尿液中的表达，探讨NLRP3炎症小体在儿童AAV发病中的作用，以期为临床进一步研究提供参考。
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资料与方法1.1 样本来源 回顾性研究。收集中山大学附属第一医院小儿肾脏风湿病中心2003年9月至2020年9月诊断并行肾活检的1~18岁原发性AAV患儿资料。AAV的诊断符合2012年Chapel Hill 共识会议AAV诊断标准［12］。本研究经中山大学附属第一医院医学伦理委员会批准［批准文号：伦审(2021)529］，患儿监护人均知情同意。1.2 方法 收集患儿性别、年龄、标本留取时间、肾活检时临床和病理指标包括24 h尿蛋白定量、尿红细胞计数、C反应蛋白(CRP)、补体C3、C4水平、儿童血管炎活动度评分(Pediatric Vasculitis Activity Score,PVAS)、肾活检时估算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)、治疗6个月时及随访终点的eGFR、肾组织球性硬化比例、新月体比例。将所有儿童分为病例组和对照组，病例组再分为活动组和缓解组。缓解定义为患儿肾功能、尿检指标稳定，肾外体征改善或趋于稳定，无进行性恶化且PVAS评分≤5分；活动定义为患儿PVAS评分>5分且不符合上述指标中的任意一项［13］。活动组均取初诊肾活检时留取的标本，肾组织标本留取时间为2003年9月至2020年9月，血尿标本留取时间为2015年9月至2020年9月。缓解组缓解期无肾组织标本,血尿标本留取时间同活动组。对照组为同期肾移植科正常供肾肾组织标本及门诊体检健康儿童的血尿标本。在肾活检时收集患者肾组织标本并制成石蜡块，采用免疫组织化学法检测肾组织中NLRP3炎症小体的定位并进行半定量评分，NLRP3多克隆抗体购于美国 Novus Biologicals 公司。活动期患儿于肾活检时静脉采血1次，注入用肝素钠浸润过的1.5 mL的离心管内，并留取当日尿；缓解期患儿静脉采血1次，留取方法同上，并留取当日尿；对照组取体检后剩余的血液标本及尿标本。所有标本4 ℃静置2 h，离心机3 000 rpm，离心半径195 mm，4 ℃，离心 10 min 后分离血清和尿上清液，保存于-80 ℃冰箱。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血、尿中IL-1β、IL-6、IL-18水平，ELISA试剂盒购于美国安迪公司，并按照试剂盒说明书进行操作。1.3 半定量评分 NLRP3炎症小体阳性表达为细胞膜或胞质内呈现棕黄色颗粒。每例镜下随机采集5个视野(×400)，以镜下阳性细胞百分比和染色强度的乘积为最终评分，分别观察肾小管间质和肾小球。(1)染色细胞占细胞总数百分比<5%计为0分；5%~25%计为1分；26%~50%计为2分；50%~75%计为3分；>75% 计为4分。(2)未染色计为0分；浅黄色计为1分；棕黄色计为2分；褐色计为3分。(3)两者相乘即为最终半定量评分。1.4 统计学处理 使用SPSS 25.0软件进行统计分析，使用GraphPad Prism 8.0软件进行绘图制作。正态分布的计量资料以x̄±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素ANOVA检验；非正态分布计量资料以M(Q1，Q3)表示，采用Wilcoxon符号秩和检验比较。分类变量以百分比表示，采用χ2检验比较。采用Pearson相关系数或Spearman秩相关系数分析变量间相关性。P<0.05为差异有统计学意义。
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结果2.1 AAV患儿肾组织中NLRP3炎症小体的定位及表达2.1.1 一般资料 AAV活动组共纳入22例患儿，中位年龄9.5(7.9，11.2)岁，其中男2例、女20例，男女比例1∶10，见表1；对照组共12例，其中男2例，女10例，男女比例1∶5。
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讨论NLRP3炎症小体作为炎症反应的核心，参与了2型糖尿病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等多种疾病，但其在儿童AAV中的作用尚不完全清楚。Tashiro等［10］报道，在MPO-ANCA相关性肾炎成人患者中，巨噬细胞严重浸润区可检测到NLRP3炎症小体，但在肾小球中缺失或仅轻微表达。本研究中，NLRP3炎症小体广泛表达于肾小管间质，而肾小球中表达量较少，且活动组的表达强度显著高于对照组，表明NLRP3炎症小体于AAV患儿的肾组织中表达，且主要表达于肾小管间质，与既往成人研究一致。进一步发现活动组肾小管NLRP3半定量评分与肾活检时患儿PVAS评分呈正相关，与eGFR呈负相关，提示NLRP3炎症小体的表达量与患儿疾病活动度及肾功能有关，NLRP3 炎症小体可能在AAV的发病中起作用。Wang等［11］的研究显示NLRP3 在成人AAV患者肾组织中的水平与临床病理指标间并无相关性，这可能是成人与儿童患者的不同之处，但需要扩大样本量进一步研究。除NLRP3炎症小体外，其下游IL-1β、IL-6、IL-18也可能参与了AAV的发病。Schreiber等［14］的研究表明，阻断IL-1β受体可改善MPO-ANCA小鼠的疾病状态，提示阻断IL-1β受体可能是一种有前景的AAV治疗策略。Anakinra是一种天然IL-1β受体拮抗剂的非糖基化重组形式，可阻断NLRP3炎症小体依赖的IL-1β信号，目前已成功应用于2型糖尿病、石棉肺和其他疾病的治疗［15］。Tocilizumab是一种拮抗IL-6受体的单克隆抗体，已被批准用于巨细胞动脉炎的治疗。有研究报道，17例成人AAV患者在接受Tocilizumab治疗后，88.2%的患者达到缓解［16］。然而，由于NLRP3炎症小体定位于巨噬细胞，常规方法较难检测，因此通过检测NLRP3炎症小体下游IL-1β、IL-6、IL-18来探究其与儿童AAV的发病及与疾病活动之间的关系也具有重要意义。本研究结果显示，活动组血IL-1β和IL-18水平均与NLRP3 半定量评分呈正相关，提示IL-1β、IL-18可能也在AAV的发病中起作用。本研究还发现活动组血IL-1β、尿IL-6、血IL-18 水平均高于缓解组和对照组，O′Brien 等［17］在成人AAV患者中发现血清IL-1β、IL-18水平高于对照组；Matsumoto等［18］在成人AAV患者中发现血清IL-1β、IL-6水平高于对照组，提示成人或儿童患者血、尿IL-1β、IL-6、IL-18可间接反映AAV的疾病活动状态，可作为评估疾病活动的参考指标。活动组血IL-6、IL-18水平分别与肾活检时CRP、PVAS评分存在相关性，提示AAV患儿血IL-6、IL-18可能与疾病活动度有关；血IL-18水平与球性硬化比例呈正相关，提示血IL-18可能与AAV患儿的肾脏病理进展有关；血IL-18水平与肾活检时eGFR值呈负相关，提示血IL-18升高可能与AAV患儿的肾功能进展有关。Matsumoto等［18］在成人AAV患者中发现，血清IL-1β、IL-6、IL-18水平与疾病状态同步变化，且与患者CRP、ANCA滴度、PVAS评分等临床指标存在相关性；Borgmann 等［19］在成人AAV患者和正常对照组中检测了IL-1β的基因，结果显示相较于对照组和未进展至终末期肾脏病的AAV患者，进展至终末期肾脏病的AAV患者IL-1β的基因表达显著增加，这些结果与本研究结果类似，表明IL-1β、IL-6、IL-18可间接反映AAV的疾病活动状态，可作为疾病活动评估的参考指标之一。本研究也存在一定的局限性。首先，本研究的样本量较少，拟扩大样本量后进一步探究NLRP3炎症小体在AAV中的作用。其次，本研究只进行了组织学实验，拟从细胞层面、动物层面进一步探究NLRP3炎症小体在AAV中的作用机制。综上所述，本研究中，NLRP3炎症小体多表达于AAV患儿肾小管间质，活动组肾小管NLRP3半定量评分与肾活检时患儿PVAS评分呈正相关，与eGFR呈负相关，提示NLRP3炎症小体参与AAV的发病和进展。AAV患儿血、尿IL-1β、IL-6、IL-18水平可间接反映AAV的疾病活动状态，可作为疾病活动评估的参考指标之一。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
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