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作者：赵小媛1 张文1 黄永兰2 苏雪莹1 李秀珍1 盛慧英1 曾春华1 尹曦1 刘宗才1 蔡燕娜1 刘丽1通信作者：张文，Email:zhw2001zhw@163.com作者单位：1广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心遗传与内分泌科，广州 510623;2广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心新生儿筛查中心，广州 510623本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(24):1879-1882.引用本文：赵小媛,张文,黄永兰,等.艾杜糖-2-硫酸酯酶活性测定在黏多糖贮积病 Ⅱ 型产前诊断中的应用[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(24):1879-1882.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20220623-00763.
摘要
目的 评估黏多糖贮积病Ⅱ型（MPSⅡ）高危孕妇胎儿绒毛和孕妇外周血血浆艾杜糖-2-硫酸酯酶（IDS)活性以及基因分析在MPSⅡ产前诊断中的应用。方法 回顾性分析2013年2月至2020年12月在广州市妇女儿童医疗中心进行产前诊断的23例MPSⅡ高危孕妇的酶学检测及基因分析结果，采用人工底物荧光法检测胎儿绒毛（30例）和血浆（28例）IDS酶活性，以非高危妊娠孕妇的28例绒毛和34例血浆检测值为对照，绒毛同时送检基因检测和胎儿性别鉴定。组间比较采用独立样本t检验。结果 非MPSⅡ高危孕妇胎儿绒毛和血浆IDS活性正常参考值为绒毛(71.2±23.4) nmol/（mg·4 h），血浆(611.1±114.5) nmol/（mL·4 h）；30例高危胎儿绒毛中8例男性受累胎儿绒毛IDS酶活性为(1.7±0.3) nmol/(mg·4 h)，显著低于11例男性非受累胎儿［(83.2±6.3) nmol/(mg·4 h)］和9例女性非携带者胎儿［(80.0±7.5) nmol/（mg·4 h）］（t=10.8、8.8,均P<0.01）。28份MPSⅡ高危孕妇外周血血浆IDS酶活性中8例受累男性胎儿孕母外周血IDS酶活性(225.4±20.5) nmol/（mL·4 h），显著低于男性胎儿非受累孕母IDS酶活性［(451.0±15.1) nmol/（mL·4 h）］和女性非携带者胎儿孕母IDS酶活性［(467.7±45.3) nmol/（mL·4 h）］。30例MPS Ⅱ 高危胎儿绒毛中找到已知致病性突变8例，突变位点分别为c.1048A>C、c.212G>A、c.514C>T、c.257C>T、c.425C>T、c.998C>T，其中6例 IDS酶活性显著降低，均为男性受累胎儿，另2例IDS酶活性正常，为女性携带者胎儿。结论 孕妇外周血血浆与绒毛IDS酶活性及基因结果有很好的相符性，对孕早期产前诊断MPS Ⅱ 有重要参考价值；当先证者未找到基因突变或新突变的致病性尚不清楚时可单独检测绒毛酶活性进行产前诊断MPS Ⅱ。
关键词
黏多糖贮积症 Ⅱ 型；产前诊断；艾杜糖-2-硫酸酯酶
黏多糖贮积病Ⅱ型(MPS Ⅱ)，又称Hunter综合征（0MIM309900)，由Hunter医师首先报道［1］，是由于艾杜糖-2-硫酸酯酶(IDS)基因缺陷引起溶酶体内IDS缺乏导致硫酸类肝素(HS)和硫酸皮肤素(DS)在全身各脏器尤其是结缔组织的溶酶体中贮积，导致全身多系统多器官功能障碍的X连锁隐性遗传性溶酶体贮积病(LSD)。MPS Ⅱ 是MPS这组疾病中最常见类型［2-3］，致残、致死率高。临床表现主要为生长迟缓、智力低下、面容丑陋、骨骼异常、关节僵硬、肝脾大及心脏病变等。目前酶替代疗法和造血干细胞移植已用于治疗，然而，在发展中国家酶替代疗法价格昂贵，一般家庭无法负担，造血干细胞移植不容易匹配到合适的供体，而且这2种疗法均不能逆转严重的神经系统损害，进行产前诊断预防患病胎儿再次出生显得尤为重要。本研究回顾分析在广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心进行产前诊断的23例MPS Ⅱ 高危孕妇的酶学检测以及基因分析结果，评估胎儿绒毛和孕妇外周血血浆IDS酶活性以及基因分析在MPS Ⅱ 产前诊断中的应用，为产前诊断的临床实践提供依据。
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资料与方法1.1 一般资料 回顾性研究。2013年2月至2020年12月在广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心进行产前诊断的23例MPS Ⅱ 高危孕妇，除2例为先证者的姨妈外所有的孕妇都生育有MPS Ⅱ 先证者，先证者皆从临床表现、尿黏多糖定量与电泳、IDS酶活性分析得到确诊。每名孕妇在孕早期(11～13周)由 B超引导下经腹进行穿刺，抽取获得的30例绒毛（其中1例孕妇产前诊断4次，1例3次，2例2次）分别送检酶学检测和基因突变分析，同时同步抽取了28例（2例未做）孕妇外周血进行血浆IDS酶活性检测；健康对照组的28例绒毛和34例血浆均来自在同期广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心行非MPS Ⅱ 产前诊断的无相关个体。产前诊断均经广州市妇女儿童医疗中心医学伦理委员会批准(批准文号：2010-31)，并获得孕妇及其家属签署的知情同意书。1.2 方法 1.2.1 绒毛标本的挑选和制备 吸新鲜绒毛于生理盐水中，挑选成形的绒毛于EP管中，用冷生理盐水漂洗2次，加适量去离子水重悬绒毛后，立即用SoniceV130超声破碎仪在4 ℃超声破碎制备匀浆或置于-40 ℃冰箱保存待制备。破碎后的匀浆用二喹啉甲酸（BCA）比色法进行蛋白定量，BCA试剂盒购自美国Sigma公司，检测步骤按说明书进行，调节蛋白浓度至1 500 mg/L。1.2.2 血浆采集 取新鲜的乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝血2 mL，静置分层后3 000 r/min离心10 min，离心半径10 cm，吸取上清至EP管中，立即检测或-40 ℃冰箱保存待测。1.2.3 酶活性检测 血浆标本检测前需用去离子水稀释5倍再行酶活性检测。制备好的绒毛匀浆与血浆均采用人工合成的荧光底物4-甲基伞形酮-α-艾杜糖-2-硫酸进行IDS酶活性检测，底物原由荷兰Moscerdan公司提供，现由英国Carbosynth公司提供。为了保证绒毛样本在前处理过程中的质量，所有绒毛均以β-半乳糖苷酶为参照酶进行样品质控，同时设置正常对照和阳性对照以确保该实验的准确性，胎儿绒毛酶活性小于正常均值的10%以下时判断为患者，在检出酶活性缺乏或显著降低时，进行双孔复测以保证结果的准确无误。1.2.4 正常对照样本 绒毛取自在门诊早期正常流产和在本中心进行非MPS产前诊断的样本；血浆取自非MPS产前诊断的孕妇外周血，在进行绒毛穿刺前进行抽血待测。1.2.5 IDS基因突变检测 使用QIAamp DNA Mini Kit（德国Qiagen）从绒毛膜中提取DNA，对IDS 9个外显子进行PCR扩增，设计的9对引物序列见表1，PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min,95 ℃ 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃ 50 s，35个循环后，72 ℃延伸10 min。通过双向Sanger测序确认纯化后的PCR产物，并使用ABI 3730 DNA分析仪（美国加利福尼亚州生命技术公司）进行测序。父母的DNA被用作阳性和阴性对照。先证者外显子测序未找到突变基因的依据Lualdi等［4］报道的方法进行基因-假基因重组检测分析。
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结果2.1 IDS活性正常参考值 28例无相关个体绒毛IDS酶活性正常值为（71.2±23.4） nmol/(mg·4 h)；34例非MPS Ⅱ 高危孕妇的外周血血浆的IDS酶活性正常值为（611.1±114.5） nmol/（mL·4 h）。2.2 胎儿酶活性结果 30例MPS Ⅱ 高危胎儿绒毛中男性胎儿19例，女性胎儿11例，共检出8例异常胎儿，均为男性受累胎儿。男性受累胎儿绒毛IDS酶活性显著低于男性非受累与女性非携带者胎儿（t=10.8、8.8，均P<0.01），远远低于健康胎儿均值的10%以下，甚至几乎没有酶活性，而男性非受累与女性非携带胎儿的IDS酶活性差异无统计学意义(t=0.3,P>0.05)，2例女性携带者胎儿因例数少不能与其他组进行比较，但这2例的绒毛酶活性在健康胎儿范围内(表2)。
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讨论MPS是溶酶体贮积病中最常见的一类疾病，包括11种类型，总发病率（1.0~16.9）/10万［1］，我国MPS中以MPS Ⅱ 型最常见，发病率最高［2-3］，是一种严重致残、致死性的X连锁隐性遗传病，通常是由患儿母亲传递而来，故患儿多为男性，女性极少见，通常为携带者。本研究对28例无相关个体的绒毛以及34例非MPS Ⅱ 高危孕妇的血浆进行了IDS酶活性检测，建立了本实验室的绒毛和血浆的正常参考值,分别为绒毛(71.2±23.4) nmol/（mg·4 h），血浆(611.1±114.5) nmol/（mL·4 h）。姚凤霞等［5］报道了孕妇外周血中IDS酶活性测定可用于MPS Ⅱ 型的非损伤性产前诊断，胎儿为男性受累胎儿时，IDS酶活性早期即显示降低，且随着孕周的增加，酶活性继续降低；胎儿为女性携带者时，孕妇外周血血浆IDS酶活性早期也是稍升高的，并随着孕周轻度升高。本研究对30例胎儿于11~13周抽取绒毛进行IDS酶活性和基因检测，同时抽取孕妇外周血进行血浆IDS酶活性检测，结果显示绒毛与孕妇外周血酶活性结果有良好的相符性，受累男性胎儿的绒毛酶活性和孕妇外周血的IDS酶活性均显著降低，明显低于男性非受累及女性非携带者胎儿（P<0.01），而男性非受累与女性非携带胎儿的绒毛和血浆酶活性比较差异无统计学意义(P>0.05),与文献报道一致［5］。早期有研究证明，MPS Ⅱ 携带者血浆中IDS酶活性较非携带者女性低［6］。但在本研究检出的2例女性携带者胎儿中，1例孕妇外周血血浆IDS酶活性是正常的而另1例是降低的，与受累男性胎儿的酶活性有重叠，与文献报道有些不一致［5］，提示单次检测孕妇外周血浆IDS酶活性时，当该酶活性降低时并不能区分是女性携带者胎儿还是受累男性胎儿，应结合绒毛酶活性和SRY基因结果进行分析。有文献报道，完全的IDS缺失占MPS Ⅱ 病例的3.0％～4.5％［7-9］。一般来说，对于产前基因诊断，先证者及其家族的基因型是明确的，但在广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心进行产前诊断MPS Ⅱ 高危孕妇中，部分先证者并未找到致病性突变基因，确诊通过临床表现、尿黏多糖定量和外周血白细胞酶活性检测进行诊断，产前诊断时仅以绒毛的酶活性结果进行判断。本研究21例孕妇曾育的先证者中，3例全部外显子扩增不成功或部分扩增不成功，其中1例为完整的片段缺失，2例为1~3和4~7号外显子缺失，无法通过直接PCR和Sanger测序检测到，因此产前诊断以绒毛IDS酶活性结果进行判断。据报道，女性杂合子的白细胞IDS酶活性明显低于非携带者女性，这由X染色体的失活和大量缺失或易位所致［10-11］。本研究的2例女性携带者胎儿，其绒毛IDS酶活性均在健康胎儿（男性非受累和女性非携带者胎儿）范围内，可见携带者绒毛与白细胞中的IDS酶活性表现并不一致，提示在绒毛中单纯检测胎儿绒毛IDS酶活性并不能区分是否为携带者胎儿；当胎儿绒毛找到致病性基因突变时，单凭绒毛基因结果也不能判断是受累男性胎儿还是女性携带者胎儿，应结合SRY基因进行分析。故在MPS Ⅱ 产前诊断中判断携带者时应结合绒毛酶活性、绒毛基因和SRY基因结果三者进行分析。有文献估计，新突变占MPSⅡ病例的15.6％～24.0％［7-8，12］。在墨西哥的25个无关的MPS Ⅱ 家庭中，新突变率为20％，1例新的MPS Ⅱ 病例被鉴定为起源于体细胞和生殖系嵌合体［13］。本研究在一个MPS Ⅱ 先证者及其母亲中发现了新突变c.457T>C（p.Trp153Arg），通过PolyPhen-2和SIFT分析考虑新的c.457T>C（p.Trp153Arg）突变可能是致病性突变,先证者IDS酶活性是缺乏的，从而可确定该突变为致病性突变，该孕妇产前诊断时胎儿绒毛酶活性和基因结果均是正常的，为健康胎儿。因此，当发现新突变判断其是否为致病性突变时，可结合酶活性结果进行分析判断。综上所述，本研究观察到胎儿绒毛IDS活性检测是一种灵敏、准确、可靠的MPS Ⅱ 高危妊娠的早期产前诊断方法；IDS酶活性与基因突变之间存在良好的相关性，当实验室现有的分子技术有限时，在先证者及母亲中未发现突变或新突变是否致病时，可以独立地用IDS酶活性检测进行产前诊断；孕妇外周血IDS酶活性检测对男性受累胎儿、男性非受累胎儿以及女性非携带者胎儿有重要参考价值，可为将来利用孕妇外周血酶学分析作为无创产前诊断提供重要依据。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
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