【实验研究】不同剂量甘草酸苷对幼年癫痫持续状态大鼠模型海马组织的保护作用

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作者：齐凤芹1　李秀敏1　马燕1　高一博1　张波2通信作者：张波，Email：lceyzhangbo@163.com作者单位：1聊城市第二人民医院（山东第一医科大学附属聊城二院）儿科，临清 252600；2聊城市第二人民医院（山东第一医科大学附属聊城二院）急诊科，临清 252600本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(18):1407-1412.引用本文：齐凤芹,李秀敏,马燕,等.不同剂量甘草酸苷对幼年癫痫持续状态大鼠模型海马组织的保护作用[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(18):1407-1412.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20220106-00020.
摘要
目的　研究不同剂量甘草酸苷对幼年癫痫持续状态（SE）大鼠模型海马组织的保护作用。方法　出生18~21 d雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠采用腹腔注射氯化锂和毛果芸香碱制作SE大鼠模型，按照随机数字表法分为5组：对照组、SE组、SE+低剂量甘草酸苷组、SE+中剂量甘草酸苷组和SE+高剂量甘草酸苷组，腹腔内注入不同剂量的甘草酸苷（20 mg/kg、40 mg/kg和60 mg/kg）。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测SE大鼠模型血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β和IL-6的水平；定量实时PCR(qRT-PCR)检测SE大鼠模型海马组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平；蛋白印迹法检测海马组织中Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达水平；苏木精-伊红（HE）染色和尼氏染色观察神经元损伤情况；末端脱氧核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记法检测神经元的凋亡情况；透射电子显微镜观察线粒体的损伤情况。采用单因素ANOVA法进行各组之间均数检验，然后采用Tukey法进行两两比较。结果　与对照组比较，SE大鼠模型血清中TNF-α［（369.69±58.07） ng/L 比 （75.46±14.64） ng/L］、IL-1β［（242.27±25.23） ng/L 比 （45.29±5.90） ng/L］和IL-6［（288.15±24.60） ng/L 比 （46.59±8.80） ng/L均显著上调，差异均有统计学意义（均P<0.05）；与SE组比较，低、中、高剂量甘草酸苷均可有效减少SE发作后血清中TNF-α［（216.67±8.31） ng/L、（158.81±5.03）ng/L、（113.69±12.54） ng/L 比 （369.69±58.07） ng/L］、IL-1β［（131.21±5.50） ng/L、（86.60±7.79） ng/L、（65.06±4.39） ng/L 比 （242.27±25.23） ng/L］和IL-6［（150.24±9.48） ng/L、（101.70±5.85） ng/L、（91.60±2.81） ng/L 比 （288.15±24.60） ng/L］的释放水平（均P<0.05)。SE造成大鼠模型海马组织神经元损伤、丢失、凋亡和线粒体损伤，甘草酸苷可以改善海马组织中神经元损伤、凋亡和线粒体的损伤。与对照组比较，SE组海马组织中Bax（0.57±0.01 比0.14±0.01）和Caspase-3（0.54±0.00 比 0.11±0.01）水平均显著升高，Bcl-2表达水平（0.27±0.01 比 0.57±0.02）下降，差异均有统计学意义（均P<0.05）；与SE组比较，低、中、高剂量甘草酸苷均可下调Bax（0.51±0.02、0.45±0.03、0.40±0.02 比 0.57±0.01）和Caspase-3（0.47±0.02、0.42±0.02、0.37±0.01 比 0.54±0.00）的表达水平，上调Bcl-2（0.41±0.02、0.45±0.02、0.51±0.01 比 0.27±0.01）的表达水平（均P<0.05)。结论　甘草酸苷可以有效保护幼年SE大鼠模型的海马组织。
关键词
甘草酸苷；癫痫持续状态；海马组织；神经元损伤
癫痫是一种慢性神经系统疾病，其特征是由异常神经元放电引起的反复发作和自发性发作［1］，癫痫持续状态（SE）是儿科和急诊科常见的急危重症，成年每年发病率为4/10万~6/10万，儿童发病率高于成人，其年发病率为10/10万~42/10万，总病死率约为3%［2-3］。SE可导致海马神经元损伤［4］，目前对于癫痫的治疗主要集中于缓解病症，但无法改变诱发癫痫症状的脑组织病理变化［5］。动物实验表明，用来阻止癫痫发作的药物治疗也可能是导致神经元损伤的原因之一，尽管尚无确凿的证据表明抗癫痫药物对癫痫患儿也造成了这种损害，但也担心抗癫痫药物可能会通过“药物诱导的细胞凋亡”而加重癫痫相关的脑损伤［6］。因此寻求具有神经保护作用的药物成为抗癫痫治疗的研究热点。甘草酸苷是从甘草根中分离得到的一种三萜皂苷，具有多种生物活性，包括抗溃疡、祛痰、抗病毒、抗炎和神经保护作用［7-8］。甘草酸苷通过其抗炎和抗氧化活性对氯化锂/毛果芸香碱诱导的SE起保护作用［9］。最近一项研究表明，甘草酸苷可通过维持癫痫大鼠血脑屏障(BBB)的完整性来抑制SE对大鼠海马组织的损害［10］。然而，甘草酸苷治疗SE的分子机制尚未完全阐明。本研究建立氯化锂/毛果芸香碱诱发的SE幼年大鼠模型，并观察不同剂量甘草酸苷对大鼠海马组织损伤的影响。
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材料与方法1.1　实验动物准备　出生18~21 d雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，体质量30~50 g，饲养于温度 22~26 ℃、湿度50%~60%环境中，光照/黑暗周期为 12 h。在动物实验期间可以自由获取食物和水。实验动物使用许可证编号：SYXK（鄂）2018-0104。1.2　SE的诱导和药物处理　大鼠适应7 d后，进行SE造模。腹腔内注射氯化锂(127 mg/kg)，18 h后给予阿托品1 mg/kg腹腔注射，30 min后给予腹腔注射毛果芸香碱(50 mg/kg)。根据Racine评分［11］评价SE的发病情况，选用 Ⅳ 级或 Ⅴ 级大鼠模型进行后续实验。当癫痫发作持续90 min后，予地西泮(10 mg/kg)腹腔注射以终止癫痫发作。将大鼠按照随机数字表法分为5组：对照组、SE组、SE+低剂量甘草酸苷组、SE+中剂量甘草酸苷组和SE+高剂量甘草酸苷组。对照组仅注射等量9 g/L盐水，不注射氯化锂和毛果芸香碱；SE组为模型组，不注射甘草酸苷；SE+低剂量甘草酸苷组将模型大鼠按照20 mg/kg标准腹腔注射甘草酸苷；SE+中剂量甘草酸苷组将模型大鼠按照40 mg/kg标准腹腔注射甘草酸苷；SE+高剂量甘草酸苷组将模型大鼠按照60 mg/kg标准腹腔注射甘草酸苷。于注射甘草酸苷后24 h用30 g/L戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉并处死大鼠，取其海马组织。1.3　酶联免疫吸附试验(ELISA)　血液标本在室温下保存30 min，然后3 500 r/min离心15 min（离心半径6 cm），用于分离血清。采用武汉贝茵莱生物科技有限公司生产的大鼠ELISA试剂盒检测大鼠血清中的肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β和 IL-6 的水平，实验严格按生产厂家说明书进行。450 nm 波长依序测量各孔的吸光度（A 值）。以标准物的A值为横坐标，浓度为纵坐标，计算出标准曲线的二次回归方程式，将样品的A值代入方程式，计算出样品浓度。1.4　定量实时PCR(qRT-PCR)　取100 mg大鼠海马组织与TRIzol试剂混合，于匀浆机匀浆20 s。按照标准的氯仿-异丙醇方案提取总RNA，并使用PrimeScriptTM Ⅱ反转录酶从总RNA(500 ng)中获得cDNA，应用CFX ConnectTM荧光定量 PCR 检测系统进行扩增并检测，使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参计算mRNA相对表达量，实验进行3次，取平均值，引物序列见表1。1.5　蛋白质印迹　采用RIPA缓冲液裂解海马组织，提取总蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析试剂盒测定蛋白浓度。然后取蛋白质样品(20 μg)，在十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶（SDS-PAGE）凝胶（120 g/L）上进行电泳，将蛋白质转移到微孔聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用脱脂牛奶封闭非特异性结合位点。将抗Bcl-2抗体、抗Bax抗体、抗Caspace-3抗体和抗GAPDH抗体按照1∶1 000比例进行稀释，将PVDF膜与抗体孵育1 h，然后与辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG(1∶10 000)在室温下孵育1 h，取增强化学发光液A和B等量混匀，加在膜的正面与之充分接触。然后将膜置于全自动化学发光分析仪中检测，通过TANON GIS软件读取相关条带灰度值。1.6　苏木精-伊红（HE）染色　大鼠海马组织脱水，石蜡包埋，冰冻切成3 μm厚的切片。切片脱蜡，复水，HE染色，并使用徕卡显微镜DM1000进行分析。1.7　尼氏染色　将石蜡包埋的海马组织切成3 μm厚的切片，脱蜡复水，56 ℃下用焦油紫染色1 h，然后用尼氏分化试剂孵育1~3 min，直至背景无色、尼氏小体清晰可见，无水乙醇快速脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，然后用徕卡显微镜DM1000进行分析。1.8　末端脱氧核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记法（TUNEL）检测　使用原位细胞凋亡检测试剂盒评估海马组织细胞凋亡情况。将石蜡包埋的海马组织切成3 μm 厚的切片，二甲苯脱蜡，乙醇复水，37 ℃下用蛋白酶K消化15 min，然后用TUNEL反应混合物孵育1 h，用转化过氧化物酶在37 ℃孵育30 min，在室温下与二氨基联苯胺（DAB）反应10 min，用苏木精复染，用徕卡显微镜DM1000进行分析。1.9　透射电子显微镜(TEM)　大鼠海马组织用25 g/L戊二醛固定30 min后，再用10 g/L锇酸固定1 h。然后，固定组织在不同浓度的乙醇和丙酮中脱水，环氧树脂包埋，用徕卡超微切片机切成60 nm厚的切片，然后用醋酸铀避光染色20 min，柠檬酸铅避光染色15 min。然后用透射电子显微镜拍摄。1.10　统计学处理　应用SPSS 21.0统计学软件，采用Kolmogrov-Smirov 法对数据进行正态性检验，数据符合正态分布，均以x̄±s表示，采用单因素ANOVA法进行各组之间均数检验，然后采用Tukey法进行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。
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结果2.1　甘草酸苷降低SE大鼠血清中促炎症细胞因子水平　SE组大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平显著上调，而甘草酸苷可以降低SE大鼠海马组织中促炎因子的表达水平，且与剂量大小有关，结果见表2。2.2　甘草酸苷降低SE大鼠海马组织中促炎症细胞因子水平　SE组大鼠海马组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA水平均显著上调，而甘草酸苷可以降低SE大鼠海马组织中促炎因子的表达水平，且剂量越高效果越明显，结果见表3。2.3　甘草酸苷减轻SE大鼠模型海马神经元损伤　HE染色观察海马CA1、CA3区病理改变。结果表明，对照组大鼠海马CA1、CA3区神经元排列整齐、紧密。细胞核呈圆形或椭圆形，核仁结构清晰可见。未见坏死神经元。SE诱导后，海马CA1、CA3区神经元排列紊乱、肿胀，体积缩小。细胞核固缩深染，核仁不明显。坏死细胞数量明显增多。经不同剂量甘草酸苷处理后，尤其是高剂量甘草酸苷治疗后，海马神经元排列正常，排列整齐，有少量坏死神经元。细胞核呈圆形或椭圆形，仅少数神经元核仁不明显(图1A)。尼氏染色显示SE后大鼠海马CA1、CA3区尼氏小体丢失。甘草酸苷治疗可显著避免SE后大鼠海马CA1和CA3区尼氏小体和神经元的丢失(图1B)。2.4　甘草酸苷抑制SE后大鼠海马神经细胞凋亡　TUNEL染色结果显示，SE组大鼠海马CA1、CA3区凋亡神经元较对照组明显增多。同时，甘草酸苷可以显著减少SE后大鼠海马CA1和CA3区神经元凋亡(图2)。2.5　不同剂量甘草酸苷对海马组织中Bax、Bcl-2和Caspase-3表达水平的影响　蛋白印迹法检测海马组织中Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达水平，结果显示，与对照组比较，SE后大鼠海马组织中Bax和Caspase-3的表达显著升高，甘草酸苷可有效下调其升高水平（P<0.05）；与对照组比较，SE后大鼠海马组织中Bcl-2的表达明显降低，但经不同剂量的甘草酸苷处理后，可以有效上调其降低水平，且剂量越高，效果越明显(表4，图3)。2.6　甘草酸苷改善SE后大鼠海马组织超微结构的变化　用透射电镜观察海马CA1区超微结构的变化。结果表明，对照组大鼠线粒体结构正常。SE组大鼠海马CA1区线粒体不规则肿胀，线粒体嵴断裂、模糊。这些超微结构改变可以被甘草酸苷改善(图4)。
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讨论甘草酸苷是高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的小分子抑制剂，其通过直接结合HMGB1BoxA，从而抑制HMGB1基因的合成并抑制其释放到细胞外、脑脊液及血清中，抑制癫痫发作过程中的炎症反应，减轻神经细胞的损伤，抑制海马星形胶质细胞和小胶质细胞的激活，并保护海马组织免受氧化损伤，从而减轻癫痫慢性期所致的海马区病理性损害，减少了神经元的丢失，在癫痫动物模型中发挥良好的神经保护作用［12-13］。癫痫的发生与炎症反应有关，并且长时间的癫痫发作也会引起炎症反应［14］。TNF-α、IL-1β和IL-6是参与炎症反应的最典型的促炎细胞因子［15］。本研究测定血清及海马组织中TNF-α、IL-1β和IL-6水平，结果发现甘草酸苷能显著抑制SE诱导的血清及海马组织中 TNF-α、IL-1β和IL-6水平的升高，提示甘草酸苷可能通过抑制促炎细胞因子的释放，对SE大鼠模型海马组织具有保护作用。反复癫痫发作可导致大鼠海马组织神经元损伤［16］。本研究通过HE染色和Nissl染色观察大鼠海马CA1、CA3区神经元损伤情况。HE染色显示SE后大鼠海马CA1、CA3区神经元排列紊乱、肿胀，细胞核固缩、深染，核仁不明显，坏死细胞增多，与文献研究结果［17-18］一致。尼氏染色观察到SE后大鼠尼氏小体的丢失，表明SE可造成海马神经元丢失，而甘草酸苷可改善上述病理改变，提示甘草酸苷可能通过减轻海马组织神经元的损伤而起到保护作用。海马神经元凋亡与癫痫发病相关，抑制海马神经元凋亡可缓解动物模型的癫痫持续发作［19-20］。采用TUNEL观察甘草酸苷对SE后大鼠海马CA1、CA3区神经元凋亡的影响，结果显示甘草酸苷能逆转SE导致的大鼠海马神经元凋亡，这与其他研究者报道的甘草酸苷的抗凋亡作用一致［21-22］。Bcl-2家族在细胞凋亡的调控中起关键作用，它包括促凋亡因子(如Bax和Bak)和抗凋亡因子(如Bcl-2和BclxL)［23］。本研究检测海马组织中Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达水平，发现甘草酸苷可阻断SE诱导的海马组织中Bax和Caspase-3的表达，上调Bcl-2的表达。提示甘草酸苷可能通过抑制海马神经元凋亡从而对SE大鼠模型海马组织产生保护作用。线粒体功能障碍是癫痫的主要原因之一，已被证明与神经细胞死亡有关，并且线粒体有希望成为治疗癫痫的有效靶点［24］。甘草酸苷已被证明在其他疾病模型中可以保护线粒体功能［25-26］，但甘草酸苷是否能够通过调节线粒体来控制SE的发生仍不清楚。本研究通过电镜观察发现，甘草酸苷能减轻SE引起的线粒体肿胀和线粒体嵴断裂、模糊，提示甘草酸苷可能通过减轻线粒体损伤从而对SE大鼠模型海马组织产生保护作用。综上所述,SE大鼠模型血清及海马组织中的促炎细胞因子显著上调，造成海马组织神经元损伤、丢失、凋亡和线粒体损伤，而甘草酸苷可以减轻这些变化，提示甘草酸苷对SE大鼠模型海马组织具有保护作用。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）

《中华实用儿科临床杂志》
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