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作者：武琼1,2 魏兵1 安然3通信作者：魏兵,Email:weib71@sina.com作者单位：1中国人民解放军北部战区总医院新生儿科，沈阳 110016;2丽水市中心医院儿科，丽水 323000；3大连医科大学北部战区总医院研究生培养基地，沈阳 110016本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(19):1486-1489.引用本文：武琼,魏兵,安然.扩张型心肌病6例全外显子测序分析[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(19):1486-1489.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20220401-00351.
摘要
目的 探究与扩张型心肌病（DCM）发生相关的突变基因位点。方法 2019年12月至2021年6月，通过“儿童DCM易感基因研究项目” 招募DCM患儿6例和健康儿童3例进行前瞻性研究。6例患儿,年龄4个月~14岁,其中女5例,男1例；3例健康儿童，年龄3~13岁，其中女2例,男1例。对研究对象进行全外显子测序，应用生物信息学方法筛选致病基因，同时采集对应患儿一级亲属静脉血，对基因突变所在区域进行一代测序。结果 共筛选出4个可能与DCM相关的突变基因位点，患儿1发现亲联蛋白2（JPH2）基因 c.2011-3C>G突变，受检者为纯合突变（GG），受检者父母为杂合突变(CG)。患儿1同时发现肌联蛋白（TTN）基因c.G49415A突变，受检者为纯合突变（AA），受检者父母为杂合突变(GA)。患儿4发现TTN基因c.G23033A突变，受检者及受检者父亲为杂合突变(GA)，其母为野生型（GG）。患儿5发现TTN基因c.16975_16978del突变，受检者及受检者父亲为杂合突变(TCTTC/T)，其母为野生型（TCTTC/TCTTC）。结论 本研究共发现4个与DCM发病相关的致病基因位点，丰富了DCM疾病基因谱，为精准医疗的实施提供了靶点。
关键词
扩张型心肌病；儿童；全外显子检测；基因突变
儿童扩张型心肌病(DCM)是一种以双心室扩大伴心脏收缩功能减低为特征的罕见疾病，主要表现为心力衰竭、心律失常、附壁血栓形成及猝死。美国一项流行病学调查显示，DCM的年发病率在儿童出生第1年为4.58/10万人，1~18岁儿童的年发病率为0.34/10万人［1］。2016年至2018年我国33家医院4 981例住院儿童心肌病调查分析显示，DCM患儿为1 641例（32.95%），是住院儿童占比最高的心肌病［2］。DCM患儿的发病年龄较小［1-4］，确诊平均中位年龄约为13个月，因小婴儿无法表达心脏不适感，因此易被忽视，延误诊断。2010年Wilkinson等［5］在一项历经15年的回顾性队列中发现，43%的儿童确诊DCM时尚不足1岁，73%在诊断时已患有心力衰竭。虽然随着医疗技术的不断进步，一些新药例如沙库巴曲缬沙坦［6］等逐渐应用于临床，提高了DCM患者的存活时间，但DCM患儿死亡率仍较高［7］。有研究显示，DCM患儿诊断后1年无移植存活率为61.1%，5年存活率为48.0%，10年存活率为42.8%［8］。与成人相比，DCM患儿治疗的希望更大,因此应早发现、早诊断、早期明确病因，从而精准治疗。本研究通过对DCM患儿的外周血DNA进行全外显子基因测序，探索与DCM发生密切相关的突变基因，为精准化诊治DCM提供依据。
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资料与方法1.1 研究对象 2019年12月至2021年6月，通过“儿童DCM易感基因研究项目” 招募DCM患儿和健康儿童进行前瞻性研究。DCM患儿入选标准：（1）左心室舒张末期内径（LVEDD）男童>55 mm，女童>50 mm（或根据患儿年龄和体表面积进行估算，>LVEDD预测值的117%）；（2）左心室射血分数（LVEF）<45%，左心室短轴缩短率（LVFS）<25%；（3）有详细临床资料、相关检查资料等。健康儿童无DCM家族史，心脏超声检查结果正常。患儿及其监护人均知情同意，并签署知情同意书，本研究通过中国人民解放军北部战区总医院伦理委员会批准［批准文号：伦审K（2020）29号］。1.2 全外显子测序 抽取DCM患儿及健康儿童静脉血 5 mL，提取血液DNA。将基因组DNA随机剪切成平均200 bp大小的片段,经过3个酶解步骤：末端修复、A-拖尾、与Illumina成对末端索引接头的连接。将带有生物素标记的RNA探针与特异片段文库进行液相杂交，再获取目标基因外显子，进而用PCR扩增进行目标基因的富集。测量DNA浓度，文库浓度>25 ng/μL 参考为合格文库。采用Qubit3.0进行定量，然后用NovaSeq 6000平台进行PE150测序，产生2×150 bp的成对末端读数。使用GATK分析基因突变位点，并用ANNOVAR注释。在CLNDN、HGMD_Phenotype、KEGG、OMIN_disease、HPO、HGMD数据库筛选关键词“DCM”，将发现的致病基因位点与其进行比对。应用1000g2015aug、ExAC、gnomAD exome等人群基因突变频率数据库对突变基因位点进一步筛选。使用在线预测软件“MutationTaster、CADD、REVEL、dbscSNV_ADA、Spliceman” 对突变基因位点蛋白危害性进行评分。1.3 一代测序 筛选出致病基因后，采集对应患儿一级亲属静脉血5 mL，对基因突变位点所在区域进行双脱氧法（Sanger）测序。反应条件为：95 ℃预变性，94 ℃变性25 s，56.5 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，35次循环；72 ℃延伸5 min。
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结果2.1 一般临床资料 共招募6例DCM患儿及3例健康儿童，其临床资料见表1。
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讨论DCM具有遗传异质性，有40多个基因与DCM相关。这些基因编码细胞骨架、心肌结构蛋白、离子通道蛋白、线粒体和RNA结合蛋白等。本研究共发现4个基因位点与DCM相关,均为国内外首次报道。其中JPH2基因编码亲联蛋白2，是T-小管-肌浆网连接蛋白质家族中的一员，其通过12~15 nm 的连接裂隙将T管连接到肌浆网，并允许L型钙通道和2型内质网钙通道蛋白受体之间的偶联，促进钙诱导心肌细胞中钙的释放。2019年Chan等［9］研究提示JPH2蛋白水解是T小管重构和心脏收缩功能障碍的决定因素，表明JPH2表达下调可能是病理性心脏重构的基础，JPH2对维持正常的心肌收缩力至关重要。TTN基因编码肌联蛋白，是人体心脏中存在的最大蛋白质，能够为心肌提供动力，并参与调节肌节收缩及细胞信号传导［9］。目前TTN突变导致DCM的致病机制尚不清［10-13］，最常见的推论为TTN突变可能导致心脏表达的肌联蛋白缩短，通过“毒肽”机制损害心肌细胞和肌节功能。2018年Chopra等［14］通过细胞实验，分离出了缩短的TTN蛋白，发现TTN突变的心肌细胞由于失去了β肌球蛋白在TTN上的结合位点，不能有效形成肌节,进而导致心脏收缩功能减低。携带JPH2突变的DCM患者鲜有报道。2016年Sabater-Molina 等［15］调查了DCM家系的12名家庭成员，其中9名携带JPH2基因p.Glu85Lys突变，这也是JPH2基因导致DCM的首次报道。随后2019年Jones等［16］在中东人群中发现一种与新生儿DCM相关的JPH2新纯合子突变（c.1920dupT）。2020年Miura等［17］报道了1例伴JPH2基因复合杂合突变(p.T237A)的日本婴儿DCM猝死病例。目前缺乏JPH2基因突变与DCM患者临床表型相关联的研究。本研究中JPH2基因突变相关病例在确诊DCM后病情迅速进展直至进行心脏移植手术，而中东［16］及日本［17］报道的病例均于幼年猝死，这提示携带JPH2基因突变的儿童可能表现为严重的心力衰竭，且死亡率较高。2016年Reynolds等［18］发现腺病毒9型介导的JPH2过表达可阻止横断性主动脉缩窄小鼠心力衰竭的发展，JPH2靶向治疗可能延缓心力衰竭时的病理性心脏重构，这也为JPH2基因突变相关DCM患者的精准治疗提供了一个新的思路。在TTN突变阳性的DCM患者家属中，许多基因突变携带者一生中都无临床症状［19］。本研究也发现，患儿4与患儿5的父亲与患儿具有同样的基因型，但均未发生DCM，这表明TTN突变具有不完全外显性。研究表明，在存在无症状心脏超声改变(轻度左心室扩大或收缩功能减低)的TTN基因突变DCM家系成员中，约10%的个体在5年内发展为DCM［20-21］。因此，建议对基因型阳性但无症状的患者家属进行定期心脏筛查，以发现心脏早期改变，进行临床干预［22］。对于TTN基因突变与DCM患者临床表型的关联性，目前研究结论不尽相同［23］。2015年Roberts等［24］的研究显示，TTN基因突变患者预后欠佳，与其他基因突变相比左心室收缩功能更差，心脏移植需求率更高，有较高的死亡率。2017年Jansweijer 等［25］的研究则提示，与其他原因引起的DCM患者相比，TTN基因突变患者的临床症状较轻，对标准药物治疗的反应更好，发生恶性心律失常及心脏移植需求的可能性更低。本研究中携带TTN基因突变患儿目前规律口服抗心力衰竭药物治疗，病情稳定，无恶性心律失常、严重心力衰竭等临床表现，提示TTN突变DCM患者临床症状稳定，但仍需进一步随访观察及大样本病例对照研究才能得出更准确的结论。综上，本研究共发现4个DCM相关基因突变，但仍需进一步大样本的验证或体外试验对其致病性进行探究。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
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