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| 面向临床，突出实用
作者：钱古柃1 边佳昕2 黄新文1 童凡1 杨建滨1 吴鼎文1 杨茹莱1 肖锐2 赵正言1通信作者：肖锐,Email:xiaorui@biosan.cn;赵正言,Email:zhaozy@zju.edu.cn作者单位：1浙江大学医学院附属儿童医院遗传代谢科，国家儿童健康与疾病临床医学研究中心，国家儿童区域医疗中心，杭州 310052；2出生缺陷防控关键技术国家工程实验室诊断试剂研发中心，杭州 310007本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2023,38(1):37-42.引用本文：钱古柃,边佳昕,黄新文,等.生化与热点基因筛查新生儿遗传代谢病的多中心研究[J].中华实用儿科临床杂志,2023,38(1):37-42.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20221105-01261.
摘要
目的 探讨新生儿遗传代谢病生化和热点基因筛查的检测效率。方法 本研究为前瞻性多中心研究。对来自10个省区12家医院的2020年11月至2021年11月出生的21 442例新生儿样本进行生化和热点基因联合筛查。生化筛查包含葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症酶活性检测及新生儿串联质谱筛查。基因筛查包括75种新生儿疾病相关的135个基因。结果 收集到各地区生化筛查结果的新生儿数目为21 205例，初筛阳性813例，经召回复查累计确诊95例（0.45%）。纳入研究的新生儿样本均进行基因筛查总计21 442例，初筛阳性168例，确诊156例（0.73%）。生化结合基因筛查可提高包括原发性肉碱缺乏症、新生儿肝内胆汁淤积症及2-甲基丁酰甘氨酸血症等疾病的检出敏感性，并扩大筛查范围，将较为常见的单基因遗传病，如珠蛋白生成障碍性贫血及肝豆状核变性等疾病纳入检测范围。结论 在新生儿筛查中，联合使用生化筛查和基因筛查可以扩大筛查范围，提高筛查效率。
关键词
新生儿筛查；遗传代谢病；多中心研究；生化筛查；基因筛查
新生儿筛查（NBS）是最有效的公共卫生项目之一［1］。NBS旨在识别出患有进行性的、可干预的、严重单基因遗传病患儿，进而降低新生儿发病的严重后果［2］。疾病的早发现早治疗可以极大提高遗传病患儿的生存质量，避免患儿机体各器官受到不可逆的损害，且具有治疗成本低，医疗系统负担小等优势［3］。自1961年第1次NBS开始，陆续有很多筛查技术已被运用，例如放射免疫分析、比色和荧光测定以及酶活性检测、等电聚焦、高效液相色谱法等［4］。其中，串联质谱的应用具有跨时代的意义，该技术使得NBS能够通过对单个血斑的分析，检测到包括氨基酸代谢、有机酸代谢和脂肪酸降解等机体生化过程相关的多达50种生化指标的变化。随着分子技术的引入，二代测序技术（NGS）的应用可以实现更多遗传性疾病的检测［5］，如囊性纤维化［6］、严重联合免疫缺陷（SCID）［7］和脊髓性肌萎缩症（SMA）等［8］。本研究通过对来自10个地区的21 442例新生儿样本进行生化联合基因筛查，确诊包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症（G6PDD）和高苯丙氨酸血症 (HPA)等在内的多种遗传性疾病，旨在为NBS方法的优化提供参考。
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资料与方法1.1 研究对象 前瞻性多中心研究。本研究与来自10个省区的12家医院合作，随机选取2020年11月至2021年11月出生的、符合本研究入组标准的21 442例新生儿样本进行研究。其中山东省妇幼保健院1 907例，济南市妇幼保健院1 990例，山西省妇幼保健院2 050例，山西长治市妇幼保健院904例，宁波市妇幼保健院2 060例，中科院附属深圳医院1 999例，新疆维吾尔自治区妇幼保健院1 789例，宁夏回族自治区妇幼保健院1 837例，长沙市妇幼保健院2 019例，重庆市妇幼保健院1 874 例，贵阳市妇幼保健院2 013例，云南省妇幼保健院1 000例样本。本研究通过浙江大学医学院附属儿童医院医学伦理委员会批准（批准文号：2019-IRB-121），新生儿监护人均知情同意并签署知情同意书。同时通过中国人类遗传资源管理办公室采集批准（2020-CJ0984号）。1.2 研究纳入及排除标准 本研究的新生儿纳入标准：（1）新生儿已经或即将进行传统NBS；（2）中国单胎新生儿；（3）父母身体健康，无严重急慢性病史及明确遗传性疾病；（4）父母其中一方签署知情同意书，自愿参与；（5）接受随访至项目结束。排除标准：（1）父母不是中国人；（2）婴儿年龄>28 d；（3）多胎妊娠之一；（4）不能提供一个直径>8 mm的干血斑；（5）辅助受孕妊娠（包括一代及二代试管婴儿）以及过程中接受了三代试管检测后出生的新生儿。1.3 研究方法 1.3.1 新生儿生化筛查 本研究进行G6PD酶活性检测及48种遗传代谢病串联质谱筛查。串联筛查采用非衍生化多种氨基酸、肉碱和琥珀酰丙酮测定试剂盒（NeoBaseTM,PerkinElmer），对采集到滤纸片上的新生儿干血片中的氨基酸、琥珀酰丙酮、游离肉碱以及酰基肉碱的浓度进行测量和评估，可检测包括HPA在内的48种遗传代谢病（疾病列表见附录1）。1.3.2 新生儿基因筛查（NBGS） 本研究通过超多重PCR联合高通量测序技术，检测75种新生儿疾病相关的135个基因（基因列表见附录2），其中包含59种遗传代谢病相关的102个基因。基因筛查可覆盖除丙酮酸羧化酶缺乏症外的所有本研究生化筛查相关病种，可筛查部分基因相关性先天性的甲状腺功能低下症。实验操作采用96通道全自动核酸提取技术进行痕量血斑DNA提取；针对135个目标基因的热点突变位点区域设计多重PCR引物，通过PCR扩增富集目标区域并制备测序文库，然后采用Illumina NextSeq 500测序仪进行高通量测序。1.3.3 生信分析 将测序原始数据转化为Fastq文件，过滤去除接头及低质量序列；与人类基因组参考序列(GRCh37/hg19)比对。使用GATK软件识别序列中的突变位点，采用Annovar进行变异位点的注释。根据美国医学遗传学和基因组学学会（ACMG）的变异位点解读指南，对识别出的突变位点进行致病性分析。其中阳性检出的定义标准为：常染色体隐性遗传病，在相同基因上检出纯合或复合杂合致病性变异；常染色体显性遗传病，检出致病性变异；X染色体连锁隐性遗传病，男性检出致病性变异，女性相同基因上检出纯合或复合杂合致病性变异；X染色体连锁显性遗传病，检出致病性变异。1.4 统计学处理 描述性分析。计数资料以例表示，计量资料用范围表示。
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结果2.1 生化筛查结果 共有21 442例新生儿纳入本研究，其中收集到生化筛查结果的新生儿数目为21 205例，初筛阳性为813例（3.83%），经召回复查确诊（G6PDD以G6P/6PC比值法确诊，其他遗传代谢病经家系基因检测确诊）95例（0.45%，95/21 205）,其中G6PDD筛查18 180例，初筛阳性128例，确诊79例，阳性预测值61.72%（79/128）；串联质谱筛查21 205例，初筛阳性685例，确诊16例，阳性预测值2.34%（16/685）。多中心研究生化筛查人数及检测项目见表1。
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讨论我国是人口大国，也是出生缺陷的高发国家。NBS的目的是在临床症状出现之前或在症状轻微时发现存在潜在遗传病风险的患儿，有助于早期诊断，及早开展专业的治疗和护理，尽最大可能避免机体遭受到不可逆的损伤［9］。目前，已有多种技术方法应用于NBS，应用较多的是生化筛查的方法，具体操作为通过干血片收集出生72~168 h的新生儿足跟血，进行指定生化标志物浓度及酶活性分析［10］。随着分子技术的发展，NGS也逐渐被引入NBS策略中。NGS能够同时处理大量样本，且检测范围可以从单个基因扩展到整个基因组［11］。因此，许多研究认为NGS的应用是实现NBS项目规模扩展的重要途径［12］。生化筛查对于一些遗传代谢病具有较高的准确性，比如丙酸血症［13］和HPA［14］的筛查。但生化筛查仅围绕部分遗传代谢病开展，筛查病种有限，检测技术也存在局限性。临床通常通过检测代谢物浓度或酶活性判断疾病的发生，但实际操作中行酶活性检测的样本条件较为严苛，特异性生化指标也会根据身体状况呈现浮动变化［15］，因此，在NBS项目中通过生化分析的方式对一些疾病进行筛查时具有较高的假阳性率，如半乳糖血症［16］、酪氨酸血症1型［17］和异戊酸血症［18］等。此外，一些遗传代谢病由于现有的生化标志物不够敏感或特异，没有被纳入新生儿的生化筛查中，如N-乙酰谷氨酸合酶缺陷和氨甲酰磷酸合成酶1缺陷等［19］。应用NGS作为辅助筛查手段会在一定程度上解决生化筛查相关局限性的问题，成为辅助新生儿遗传缺陷筛查的有效方法［20］。本研究为来自10个省区的12家医院合作进行的多中心课题，探究生化与热点基因筛查优缺点，为完善NBS程序提供理论依据。本研究共入组21 442例新生儿样本进行基因筛查，初筛阳性168例（0.78%），经家系验证后确诊156例（0.73%）阳性患儿，阳性预测值高达92.86%（156/168）；其中，收集到生化筛查结果的新生儿数目为21 205例，初筛阳性为813例（3.83%），经召回复查累计确诊95例（0.45%）。其中，G6PD筛查阳性预测值61.72%；串联质谱筛查阳性预测值2.34%。在生化与基因检测重合病种中，相关遗传代谢病检出131例，单独通过生化检出阳性128例，占总检出样本数的97.71%；单独通过基因检测检出阳性127例，占总检出样本数的96.95%。由此可知，生化联合热点基因筛查的方法能够通过有限的人工筛查快速识别少数有疾病风险的个体，2种筛查技术结合可提高检测特异性和敏感性，并降低召回成本。生化筛查是基于生化标志物进行检测的筛查手段，本研究发现生化筛查在HPA、丙酸血症及短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症的检测上具有更好的灵敏度。但在新生儿生化筛查中，目标生化标志物可能受生理环境和样本运输环境的影响，或因患者症状轻微、疾病迟发，可能会出现漏筛，此种情况可通过基因筛查作为补充手段，提高检测结果准确性。本研究发现基因筛查在原发性肉碱缺乏症、2-甲基丁酰基辅酶A脱氢酶缺乏症及新生儿肝内胆汁淤积症的检测上具有更好的灵敏度。基因筛查通过检测受检者DNA中的致病性变异，基于基因型和表型的明确相关性确定疾病诊断，并不受限于特定的生化标志物，具有很高的特异性［20］。本研究检出29例未包含在本研究生化筛查范围内的疾病，占本研究阳性病例总数的18.125%（29/160），排除常规NBS可检测的听力障碍及甲状腺激素内分泌障碍外，仍有14例，如肝豆状核变性、SMA及糖原累积症等疾病的检出可通过基因筛查结果进行提示。但基因筛查也存在一定的技术局限性，比如检测目标范围仅针对相关变异基因的特定热点突变或外显子区域，无法检测到其他特殊变异，包括非编码区变异、内含子变异、拷贝数变异和复杂结构变异等。此外，本研究中的NBGS只报告致病或疑似致病的变异，但是部分罕见变异可能由于致病性判读证据不足被判读为临床意义未明变异，因而被排除在报告范围之外。基因筛查是否报告临床意义未明确的变异还存在一定争议，但是考虑到报告这一类病例会大大增加临床医师咨询和随访的负担，而且会增加受检者的焦虑，国际上专业组织建议通常只报告致病和可能致病变异［21］。通过生化与基因筛查结合的方式，可以提高检测准确性，减低漏筛风险，基因检测可以扩大筛查病种，将无明显生物标志物的遗传代谢病及非遗传代谢病纳入筛查范围。除此之外，本研究通过采集出生3 d新生儿足跟血血斑进行相关检测，新生儿生化筛查报告周期为5个工作日，热点基因筛查报告周期为10个工作日，可在严重遗传代谢病发生早期或症状出现前进行提示和干预，具有较强的时效性。综上所述，本研究说明了生化筛查和基因筛查联合的方式提高了NBS的特异性和敏感性，可以很大程度地避免错筛和漏筛，降低传统NBS假阴性发生率，扩大严重单基因遗传病的筛查范围，提高筛查效率。尽管基因筛查仍存在一些局限，NGS在改善NBS以及对遗传病的遗传机制理解方面仍然具有巨大应用潜力，这也将有助于遗传病的早期诊断并提供个性化治疗。
参考文献略
本文编辑：单卫华
数字编辑：郑成铭
制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部
《中华实用儿科临床杂志》
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