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作者：徐涛1 颜慕霞1 徐令1 杨旭1 王一倩2通信作者：王一倩，Email:353134317@qq.com作者单位：1广州市妇女儿童医疗中心血液科，广州 510623；2广州医科大学，广州医科大学-中科院广州生物医药健康研究院联合生命科学学院，广州 511436本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(11):831-836.引用本文：徐涛,颜慕霞,徐令,等.环状RNA circOMA1对儿童急性髓系白血病细胞增殖和凋亡的影响[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(11):831-836.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20210618-00702.
摘要
目的 研究环状RNA（circRNA）circOMA1在儿童急性髓系白血病（AML）中的表达及其对AML细胞系人急性单核细胞白血病细胞（THP-1）增殖和凋亡的影响及机制。方法 收集AML患儿初诊时和完全缓解后骨髓样本各14例作为初诊组及缓解组，并纳入同一时期同医院10例非恶性血液病患儿骨髓样本作为对照组。采用定量聚合酶链反应（qPCR）检测AML临床样本中和THP-1细胞系中circOMA1、miR-145和骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物（MYC）mRNA的表达。转染THP-1细胞构建分组，单独转染circOMA1的细胞（circOMA1高表达组）采用转染pcDNA3.1空载体的细胞作为对照（pcDNA3.1对照组）；circOMA1和miR-145共转染的细胞（circOMA1+miR-145组）采用pcDNA3.1和miR-NC共转染的细胞作为对照（pcDNA3.1+miR-NC组、circOMA1+miR-NC组）。采用细胞计数试剂盒（CCK8）检测circOMA1及miR-145对 THP-1细胞增殖的作用，采用流式细胞技术检测circOMA1及miR-145对THP-1细胞凋亡的影响，采用Western blot法检测circOMA1及miR-145对MYC蛋白表达的影响。组间比较采用独立样本t检验或配对样本t检验分析，相关性采用Pearson相关性分析。结果 初诊组的circOMA1表达水平（4.408±3.607）高于对照组（0.998±0.560），差异有统计学意义（t=2.946，P<0.01）；缓解组circOMA1表达水平（1.582±0.950）低于初诊组，差异有统计学意义（t=3.628，P<0.01）。THP-1细胞实验显示，与pcDNA3.1对照组相比，circOMA1高表达组miR-145的表达降低（t=4.21，P<0.05），72 h和 96 h 细胞增殖增强（t=5.46、7.40，均P<0.05），细胞凋亡被抑制（t=6.44，P<0.01）。circOMA1+miR-NC组MYC蛋白的表达高于pcDNA3.1+miR-NC组（t=5.72，P<0.01），circOMA1+miR-145组的MYC蛋白表达低于circOMA1+miR-NC组（t=4.56，P<0.05）；在72 h和96 h时，circOMA1+miR-NC组的细胞增殖水平均高于pcDNA3.1+miR-NC组（t=5.77、7.30，均P<0.05），circOMA1+miR-145组的细胞增殖水平均低于circOMA1+miR-NC组（t=4.66、6.17，均P<0.05）；circOMA1+miR-145组细胞凋亡率高于circOMA1+miR-NC组（t=4.25，P<0.05）。临床样本检测发现，circOMA1的表达与miR-145的表达呈负相关（r=-0.62，P=0.016），与MYC基因的表达呈正相关（r=0.64，P=0.013）。结论 circOMA1在儿童AML中表达升高，并可通过miR-145/MYC途径促进AML细胞增殖，抑制凋亡，有望为AML的治疗和诊断提供理论依据。
关键词
急性髓系白血病；circOMA1；细胞增殖；凋亡；miR-145
急性白血病（AL）是儿童最常见的肿瘤性疾病。其中，急性髓系白血病（AML）约占20%，但其致死率却占儿童AL的50%以上［1-2］。虽然，随着诊疗技术和医疗水平的提高，AML的治疗已有较大改善，但仍存在预后差及易复发的治疗困境［3］。因此，研究AML的发病机制及发现新的治疗靶点极为重要［4］。有研究发现，环状RNA（circRNA）在肿瘤等疾病的发生发展中发挥重要作用［5-6］。circRNA是一类由线性RNA的5′端和3′端首尾相连结合在一起后形成的环状闭合RNA［7］，其可通过阻断microRNA（miRNA），与蛋白结合或翻译成功能蛋白等方式发挥作用［8-9］。研究表明，hsa_circ_0121582、hsa_circ_0004277、circMYBL2等circRNA在AML中均产生作用，并具有成为生物标志物的潜能［10-12］。目前，尚未见有关于circOMA1（has_circ_0000072）在AML中的相关研究。本研究对circOMA1在AML中的表达和功能进行探讨，以期为AML的治疗和诊断提供新的理论依据。
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材料与方法1.1 试剂与仪器 Ficoll单个核细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司，DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、TRIzol及转染试剂Lipofectamine Stem均购自美国Thermo Fisher公司；细胞计数试剂盒（CCK8）购自江苏碧云天生物技术有限公司；circRNA表达载体 pcDNA3.1(+) circRNA Mini Vector购自上海海吉浩格生物科技有限公司；miR-145 mimics及对照miR-NC购自苏州吉玛基因股份有限公司；反转录PCR（RT-PCR）试剂盒、miRNA反转录试剂盒及荧光定量检测试剂盒购自大连宝生物公司；细胞周期和细胞凋亡检测试剂盒均自美国BD公司；骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物（MYC）蛋白抗体购自美国CST公司；增强化学发光法（ECL）显色试剂盒购自美国Bio-Rad公司。离心机及核酸分析仪均购自美国Thermo公司；QuantStudio 6定量PCR仪购自美国ABI公司；流式细胞仪购自美国BD公司，化学发光成像仪购自美国Bio-Rad公司。1.2 组织样本和细胞系 采集2016年1月至2017年1月就诊于广州市妇女儿童医疗中心的AML患儿骨髓作为样本，并将病例中治疗后达到完全缓解的初诊时和缓解后对应的骨髓样本分别作为初诊组和缓解组。治疗采用DAE（柔红霉素、阿糖胞苷、依托泊苷）或 HAD（高三尖杉酯碱、阿糖胞苷、柔红霉素）等标准化疗方案。纳入标准：（1）经临床和实验室检查确诊为AML，AML诊断分型和疗效标准参照文献［13-14］，排除M3型病例；（2）患儿年龄0~16岁；（3）未患有其他类型白血病或肿瘤等恶性疾病；（4）治疗后获得完全缓解并且能够收集到足够的骨髓标本用于后续实验。排除标准：未完全缓解病例的初诊时和治疗后的样本。最终共纳入14例患儿（M2型4例、M4型3例、M5型5例、M7型2例），其中男8例（57.14%），女6例（42.86%）；初诊时年龄1~16（6.6±2.7）岁。此外，纳入同一时期排除白血病和其他恶性肿瘤的血液病患儿10例作为对照组，其中男6例（60.00%），女4例（40.00%）；年龄1~16岁（6.9±3.2）岁。AML患儿和对照组患儿在性别和年龄上差异均无统计学意义（均P>0.05）。AML细胞系人急性单核细胞白血病细胞（THP-1）购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。本研究通过广州市妇女儿童医疗中心医学伦理委员会批准（批准文号：2015020933），患儿监护人均知情同意并签署知情同意书。1.3 方法1.3.1 骨髓单个核细胞的采集与保存 采用Ficoll 梯度密度离心法分离骨髓单个核细胞。（1）用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管收集2 mL骨髓；（2）将骨髓转入新的离心管，加入等体积磷酸盐缓冲溶液（PBS）稀释；（3）加入与稀释后骨髓等体积的分离液；（4）室温，600×g，水平离心20 min后出现分层；（5）吸取白膜层细胞至新的离心管中，PBS洗涤，250×g离心10 min；（6）弃上清液，重复洗涤、250×g离心10 min，2次，保存于-80 ℃冰箱备用。1.3.2 细胞转染 THP-1细胞采用含100 g/L的胎牛血清的DMEM培养基常规培养于37 ℃、50 ml/L CO2、饱和湿度的培养箱中。采用pcDNA3.1(+) circRNA Mini Vector 构建circOMA1的表达载体，利用 Lipofectamine stem将其单独或与miR-145同时转染THP-1细胞。单独转染circOMA1的细胞（circOMA1高表达组）采用转染pcDNA3.1空载体细胞作为对照（pcDNA3.1对照组）；circOMA1和miR-145共转染的细胞（circOMA1+miR-145组）采用pcDNA3.1和miR-NC共转染的细胞作为对照（pcDNA3.1+miR-NC组、circOMA1+miR-NC组）。载体的转染浓度为1 μg/mL，miRNA的转染浓度为50 nmol/L。转染后根据需要在不同时间点收集细胞用于后续实验。1.3.3 基因表达检测 采用TRIzol试剂提取临床样本和细胞系中总RNA，核酸分析仪检测RNA浓度和纯度。通过TargetScan［15］和miRanda［16］生物信息数据库筛选出circOMA1的下游靶点miRNA（miR-136、miR-145、miR-153、miR-302d、miR-606）。取总RNA 1 μg，按RT-PCR和miRNA反转录试剂盒操作说明分别合成circOMA1、MYC和miRNA的cDNA。采用QuantStudio 6定量PCR仪检测circOMA1和miRNA的表达情况。反应程序：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性 5 s，60 ℃退火和延伸 30 s，共35个循环。基因的表达采用2-△△CT法计算分析，circOMA1和MYC以GAPDH作为内参基因，miRNA以U6作为内参基因。circOMA1正向引物为：GAAAAGGCTGGCATGGTTCA，反向引物为：CACCATTTCCTTATGCCCCTG；MYC正向引物为：CGGGGCTTTATCTAACTCGCTG，反向引物为：ACCGAGTCGTAGTCGAGGTCA；GAPDH正向引物为：AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，反向引物为：AGGGGCCATCCACAGTCTTC。miR-136、miR-145、miR-153、miR-302d和miR-606的正向引物分别为：ACTCCATTTGTTTTGATGATGGA、GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT、TCATTTTTGTGATGTTGCAGCT、TAAGTGCTTCCATGTTTGAGTGT和AAACTACTGAAAATCAAAGAT。1.3.4 细胞增殖检测 THP-1细胞转染6 h后，收集细胞，重悬于含100 g/L胎牛血清的DMEM完全培养基中，以1×104细胞／孔的浓度铺于96孔板中，设置3个复孔。分别于0 h、24 h、48 h、72 h和96 h使用CCK8试剂盒检测细胞活性，每孔加10 μL CCK8，37 ℃孵育2 h，然后利用酶标仪测定450 nm波长处的吸光度，根据同一时间点同一组内复孔的检测值计算平均值。1.3.5 细胞凋亡检测 THP-1细胞转染72 h后，300×g离心5 min收集，按Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒说明书进行操作：（1）用预冷的PBS洗涤2次，300×g4 ℃离心5 min；（2）弃上清液，加入100 μL染色缓冲液，重悬细胞；（3）加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染色液，室温、避光孵育10 min；（4）加入400 μL缓冲液，混匀后置于冰上，1 h内用流式细胞仪检测凋亡。采用FlowJo软件进行数据分析。进行3次独立重复实验。1.3.6 Western blot法检测MYC蛋白水平 THP-1细胞转染72 h后，250×g离心10 min 后收集，预冷的PBS洗2次，加入细胞裂解液冰上裂解 20 min，12 000×g离心15 min提取总蛋白，采用二辛可酸（BCA）法检测其浓度。取 30 μg 蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜；50 g/L脱脂乳室温封闭2 h，弃封闭液后加入一抗 4 ℃过夜孵育；TBST洗涤3次，加入二抗室温孵育 1.5 h；采用ECL试剂盒显影，ImageJ软件进行灰度分析，蛋白表达量用 MYC蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示。1.4 统计学处理 采用SPSS 14.0统计学软件进行分析处理，计量资料以x̄±s表示，组间比较采用独立样本t检验或配对样本t检验，相关性采用Pearson相关性分析。所有检验均采用双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。
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结果2.1 circOMA1在AML患儿中的表达 初诊组骨髓中circOMA1的表达量明显高于对照组（4.408±3.607比0.998±0.560），差异有统计学意义（t=2.946，P<0.01）；缓解组circOMA1的表达量（1.582±0.950）明显低于初诊组，差异有统计学意义（t=3.628，P<0.01）。2.2 circOMA1对THP-1细胞增殖的影响 CCK8法检测结果显示，circOMA1高表达组与pcDNA3.1对照组在24 h、48 h、72 h、96 h的增殖水平呈不断升高趋势，但circOMA1高表达组细胞增殖水平的上升趋势更明显；在72 h和96 h时，circOMA1高表达组的细胞增殖均明显高于pcDNA3.1对照组，差异均有统计学意义（t=5.46、7.40，均P<0.05）（图1）。
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讨论AML的发生发展涉及多种细胞遗传学和分子学异常，其治疗效果差，预后不良，易复发，总体致死率占儿童AL的50%以上［2-3］。因此，对于儿童AML的分子机制和相关治疗靶点的研究极为重要。近年来研究发现，circRNA在人类细胞中广泛表达，并在疾病的发生发展中发挥重要的作用［17］。circRNA 是区别于传统线性RNA 的一类具有闭合环状结构的新型RNA，其表达具有组织特异性和时空特异性，并且相对于线性RNA更具稳定性［18］。因此，circRNA可能成为更好的生物标志物或治疗靶点。目前已知的大多数circRNA通过与miRNA结合，阻断miRNA 对其靶基因的抑制作用，充当miRNA 海绵；有部分circRNA可与蛋白相互作用而发挥功能；还有小部分circRNA本身能够翻译成蛋白质来发挥作用［8-9］。研究显示，circRNAs 与多种肿瘤的发生发展密切相关，使得 circRNA在癌症的诊断和治疗方面成为新的热点［5,19-20］。Ma等［19］研究表明，hsa_circ_0004872 通过 miR-224/Smad4/ADAR1信号通路抑制胃癌的进展，Zhang等［20］报道显示，circSATB2可通过抑制miR-326促进非小细胞肺癌的增殖。近年来研究表明，circRNA在白血病中也发挥重要作用。Sun等［12］研究发现，circMYBL2通过与PTBP1蛋白结合来调控Fms样酪氨酸激酶3（FLT3）的翻译，进而促进FLT3-内部串联重复（FLT3-ITD）型 AML的进展，而Hu等［21］的研究显示，hsa_circ_0079480可通过抑制miR-654-3p 来促进肝癌衍生生长因子（HDGF）的表达，进而促进AML细胞的增殖。以上研究表明，circRNAs在白血病的发生发展中发挥重要作用。本研究发现，circOMA1在儿童AML骨髓样本中的表达高于对照样本。circOMA1 全长865 bp，由OMA1基因的第3-8个外显子环化而成。OMA1是一种重要的线粒体金属蛋白酶，具有促进细胞凋亡的作用［22］。然而，由OMA1外显子环化形成的circOMA1在儿童AML中的表达和功能目前尚不清楚。本研究通过实时定量PCR对临床样本检测，发现circOMA1在儿童AML中高表达。AML由未成熟的髓系细胞分化异常所致，其特点是过度增殖和不易凋亡。而circOMA1是否会影响AML细胞的增殖和凋亡目前尚不清楚。本研究细胞功能实验发现，circOMA1能够促进THP-1细胞的增殖并抑制其凋亡。circRNA通过与miRNA结合来抑制miRNA 的表达和功能是其发挥作用的重要机制［23-26］。本研究通过生物信息学分析并结合定量PCR验证发现，miR-145为circOMA1的下游靶点。研究显示，miR-145 具有抑癌作用，通过抑制下游靶基因（KLF4、MYC、FSCN1、VEGF、CDCA3、NRAS等）的表达来调控细胞增殖、凋亡、分化、迁移及侵袭等生物过程［25-30］。本研究发现，circOMA1能够抑制miR-145的表达并促进MYC的表达。而miR-145的表达可逆转circOMA1对THP-1细胞的促进增殖和抑制凋亡的作用，并且逆转circOMA1对MYC蛋白表达的促进作用。因此，circOMA1可通过抑制miR-145来升高MYC蛋白的表达，进而实现促进AML细胞增殖并抑制凋亡的作用。本研究临床样本检测显示，AML患儿初诊时的circOMA1呈高表达状态，而完全缓解后的AML患儿circOMA1表达量普遍降低。且circOMA1表达量与miR-145表达量呈负相关，与MYC的表达呈正相关，进一步证实了circOMA1的作用机制，并提示circOMA1有可能成为AML治疗与诊断的生物标志物和分子靶点。综上，本研究发现CircRNA circOMA1在儿童AML中高表达，且circOMA1通过miR-145/MYC途径来促进AML的细胞增殖并抑制其凋亡，有可能成为新的治疗靶点。本研究有望为AML的治疗提供新的思路和理论依据。但在未来的后续研究中还需继续扩大样本量检测circOMA1在儿童AML中的表达，并深入探讨其可能存在的其他功能和作用机制。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
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