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作者：杨家武 赵亮 刘海沣 李银 李峰 袁廷运 付红敏通信作者：付红敏，Email:fuhongmin@etyy.cn作者单位：昆明医科大学附属昆明市儿童医院呼吸与危重症医学科，昆明 650031本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2023,38(4):281-285.引用本文：杨家武,赵亮,刘海沣,等.支气管肺泡灌洗液基因芯片法病原体检测对难治性肺炎患儿的病原学诊断意义[J].中华实用儿科临床杂志,2023,38(4):281-285.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20220807-00947.
摘要
目的 探讨支气管肺泡灌洗液（BALF）基因芯片法检测对难治性肺炎患儿病原学诊断的意义。方法 回顾性研究。收集2020年 1月至2022 年 1 月昆明医科大学附属昆明市儿童医院呼吸与危重症医学科诊断为难治性肺炎的500例患儿资料，住院期间行支气管镜检查及支气管肺泡灌洗治疗，取BALF行基因芯片法病原体检测，同时完善痰液、BALF细菌培养。采用χ2检验比较不同检测法的病原检出阳性率。结果 BALF基因芯片法病原体检测的阳性患儿482例（96.4%），仅单一病原体感染患儿71例（14.7%），另411例（85.3%）检出2种及2种以上病原体。其中，居前3位的细菌分别为：肺炎链球菌117例次（8.3%），流感嗜血杆菌63例次（4.5%），百日咳杆菌32例次（2.3%）。居前3位的病毒分别为：呼吸道合胞病毒269例次（19.1%），副流感病毒 217例次（15.4%），腺病毒132例次（9.3%）。BALF基因芯片法细菌检测阳性的患儿116例（23.2%），BALF细菌培养阳性的患儿47例（9.4%），痰培养的阳性患儿43例（8.6%），BALF基因芯片法细菌检测的阳性率最高，与BALF培养及痰培养阳性率比较，差异均有统计学意义（χ2=34.90、39.85，均P<0.001）。结论 难治性肺炎患儿大部分为混合感染，BALF基因芯片法病原学检测可快速、高效地获取病原学结果，为临床抗感染治疗提供用药指导。
关键词
儿童；难治性肺炎；病原体；基因芯片法
肺炎是儿童最常见的呼吸道疾病，部分患儿病情凶险，可迅速发展出现呼吸衰竭、循环衰竭、脓毒症等严重病情，是导致 5 岁以下儿童死亡的首位病因［1］。目前，难治性肺炎仍是临床上十分棘手的问题［2-3］。难治性肺炎包括疗效不佳的重症肺炎、久治不愈的肺炎及吸收缓慢的肺炎。难治性肺炎的形成有病原学、自身及并发症等多种因素，而病原学因素是其中比较重要的原因。支气管镜用于难治性肺炎的诊治是近年来的热点，得到了广泛肯定［4］，已成为儿童呼吸道疾病诊治中不可或缺的工具［5］。通过支气管镜直接插入到肺段、亚肺段直接吸取分泌物进行培养，当分泌物较少时可进行肺段的支气管肺泡灌洗获取支气管肺泡灌洗液（BALF）后再行病原学检测，大大提高了病原学检测的可靠程度，对临床治疗的指导意义大幅提高。目前病原学的检测方法较多，但常用的病原学检测方法如痰培养和血培养，存在阳性率低、耗时长及免疫荧光抗原抗体检测范围较窄的问题［6］；聚合酶链反应操作复杂，实验条件要求较严格，不利于基层应用。基因芯片检测技术具备同时检测多种生物信息的“高通量”特性，以及高度的检测灵敏性和特异性，测试速度快、成本低，能为临床诊疗提供快速、高效、精确的指导。本研究采集难治性肺炎患儿的BALF行基因芯片法检测病原体，探讨BALF基因芯片法病原学检测对难治性肺炎患儿的病原学诊断意义。
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资料与方法1.1 研究对象 回顾性研究。选择2020年1月至2022年1月昆明医科大学附属昆明市儿童医院呼吸与危重症医学科诊断为难治性肺炎的500例患儿为研究对象，其中男273例，女227例；年龄1个月至13岁，其中≤1岁者212例，1~3岁者148例，>3~7岁者97例，>7岁者43例。患儿均符合《中国儿童难治性肺炎呼吸内镜介入诊疗专家共识》中难治性肺炎的诊断标准［7］。入选标准：经抗感染等常规治疗2周，临床症状、体征及影像学检查无明显改善或加重者。排除标准：严重的肺部及全身基础疾病，如先天性免疫缺陷病、心血管畸形、神经肌肉疾病、遗传代谢病、呼吸道及上消化道结构畸形、肿瘤、长期接受免疫抑制剂治疗、早产儿和低体重儿等。本研究通过昆明医科大学附属昆明市儿童医院医学伦理委员会批准（批准文号：2023-03-008-K01），并豁免监护人知情同意。1.2 方法 1.2.1 标本采集 （1）痰液采集：采用负压吸痰器将无菌吸痰管从患儿单个鼻孔插入7~8 cm达鼻咽部，通过负压吸引鼻咽深部分泌物，2 mL无菌生理盐水冲洗导管，标本立即送实验室行细菌培养。（2）BALF采集：术前签署支气管镜检查知情同意书，予咪达唑仑0.1~0.3 mg/kg 镇静，阿托品 0.01 mg/kg 静脉注射，以减少呼吸道腺体分泌，操作前予奥布卡因凝胶滴鼻，术中以10 g/L 利多卡因行支气管黏膜表面麻醉，麻醉与操作同步进行。根据患儿年龄选用Olympus BF-XP260F（外径2.8 mm）和Olympus BF -P260F（外径4.0 mm）型号纤维支气管镜，术中经鼻、咽喉、声门进入气道，逐步观察气管隆突、各叶、段支气管及影像学提示的病变部位。先以37 ℃生理盐水分段灌洗，每次0.5~1.0 mL/kg，每次灌洗后予负压吸引，留取BALF标本行病原学检测。对有大片阴影或合并肺实变的肺段予重点灌洗。术中予鼻导管吸氧，术后予布地奈德雾化，全程给予血氧饱和度和心电监测。术后禁食2 h，密切观察有无并发症并及时处理。1.2.2 细菌培养 采用50 g/L羊血哥伦比亚琼脂平板及巧克力平皿按常规方法行痰液及BALF细菌培养，对临床检出病原菌采用VITEK32细菌鉴定仪（梅里埃公司，法国）鉴定菌种并做药敏试验，大肠埃希菌（E.coli)（ATCC25922）、铜绿假单胞菌（PA）（ATCC27853）为质控菌株。1.2.3 BALF病原学基因芯片法检测 基因芯片检测由昆明和合医学检验所进行。基因芯片的测序原理为杂交测序法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定。在一块基片表面固定序列已知的靶核苷酸的探针，检测杂交反应在芯片上确切位置的荧光信号，利用代表在一个目标序列内所有可能核酸序列变化的探针以迅速确定该目标序列的核酸序列。先使用盐酸胍和蛋白酶K进行标本裂解，释放总核酸，用亲和离心柱将游离的核酸特异性地吸附下来，然后使用UniEx-96 全自动核酸提取仪提取核酸行聚合酶链反应扩增，将扩增产物加入基因芯片内，然后进行杂交、洗脱、扫描，最后对结果进行分析。微阵列基因芯片杂交洗脱系统、核酸提取试剂盒（磁珠法）、呼吸系统感染性病原体基因芯片检测试剂盒均由昆明寰基生物芯片产业有限公司提供，微阵列芯片扫描仪为美国Axon公司生产。检测的病原体包括：肺炎支原体（MP）、嗜肺军团菌（LP）、肺炎衣原体（CP）、脑膜炎球菌（NM）、白色念珠菌（CAL）、结核分枝杆菌（TB）、PA、肺炎克雷伯菌（KP）、金黄色葡萄球菌（SA）、肺炎链球菌（SP）、流感嗜血杆菌（HI）、腺病毒（ADV）Ⅰ（1、2、5、6亚型）、ADVⅡ（3、4、7、21亚型）、ADV Ⅲ（8、14、19、25亚型）、鲍曼不动杆菌（AB）、百日咳杆菌（BP）、E.coli、甲型流感病毒（H1N1、H3N2、H1N2）、乙型流感病毒（IFV-B）、呼吸道合胞病毒（RSV）、副流感病毒1、2、3、4型（Pinf 1、Pinf 2、Pinf 3、Pinf 4）、鼻病毒（RHV）、人偏肺病毒（hMPV）、EB病毒（EBV）、布鲁氏菌（Bru）、A族溶血性链球菌（GAS）、B族溶血性链球菌（GBS）、巨细胞病毒（CMV）。1.3 疗效判断标准 根据患儿发热、咳嗽等临床症状，C-反应蛋白（CRP）、白细胞介素（IL）-6 等炎症指标的改善程度，以及复查胸部影像学结果评价临床疗效。疗效判定依据［8］：显效：临床症状消失，体温、CRP、IL-6 恢复正常，影像学提示肺实变好转面积≥80%病变区域；有效：临床症状消失，体温、CRP、IL-6 恢复正常，影像学提示肺实变好转面积≥50%病变区域；无效：临床症状及体征改善不明显，肺实变好转面积≤30%病变区域。总有效=显效+有效。1.4 统计学处理 采用SPSS 24.0统计学软件进行分析，计数资料以例（%）表示，采用χ2检验比较，P<0.05 为差异有统计学意义。
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结果2.1 BALF、痰培养结果及细菌分布 500例患儿中，BALF培养阳性者47例，阳性率为9.4%，痰培养阳性者43例，阳性率为8.6%，两者培养结果一致者30例，其中SP 12例，KP和HI各8例，SA 2例。BALF培养居前3位的细菌分别为SP 21例 （44.7%）、KP 12例（25.5%）、HI 11例（23.4%）；痰培养居前5位的细菌分别为SP 13例（30.2%）、HI 9例（20.9%）、 KP 8例（18.6%），E.coli 5例（11.6%），SA 5例（11.6%）。具体见表1。
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讨论难治性肺炎严重危害儿童身心健康［1］，其难治性与多种原因相关，而病原微生物因素则是其中较为重要的因素。病毒的拷贝数、病原微生物的耐药及混合感染等均可导致难治性肺炎［9］。不同病原引起的难治性肺炎特点不同，但在临床上有时很难根据临床症状、体征进行区分。影像学、白细胞计数及分类、CRP、降钙素原、红细胞沉降率等辅助检查有时也很难区分细菌与病毒感染，甚至不能判断病情的严重程度［10］。因此很长一段时间内，难治性肺炎的治疗主要依赖经验。随着医学技术的发展，如何准确获得病原，是保证治疗有效的关键，也是合理使用抗菌药物的前提［11］。目前，临床上对于难治性肺炎患者病原体的检测方法主要为痰培养、九项呼吸道病原体免疫球蛋白M抗体检测及病原体核酸检测等，每种方法均有一定的局限性。痰培养中的痰液易受到污染、培养操作复杂、耗时长、阳性率低，且无法区分致病菌和正常定植寄生菌，结果的可靠性较差［12］；九项呼吸道病原体免疫球蛋白M抗体检测采用直接或间接免疫荧光法检测病原体的免疫球蛋白M抗体，通量低，仅能检测几种病原体，不能满足同时检测多种病原体的需要［13-14］；病原体核酸检测的优点为特异性强、敏感性高，缺点为实验条件要求非常严格，同时需要精密、先进的仪器设备，不适合在基层医院应用。近年来，随着支气管镜技术在儿科领域的大力发展，支气管镜已能够满足婴儿甚至早产儿的使用要求，且并发症少、安全性高［15］，为支气管镜在儿科的广泛应用奠定了基础。特别是在肺炎病原学和病理学标本取材、气管支气管结构异常诊断、支气管塑型性物质的治疗等方面有独特的优势［16］。通过支气管镜肺泡灌洗可获取可靠的BALF标本，但BALF培养耗时长，阳性率也较低，本研究中，检测阳性率仅为9.4%，且仅能检测细菌，不能检测病毒、非典型病原等其他病原体，因此也不能满足临床需要。病原学分子诊断技术是目前病原学诊断的研究热点，其中宏基因组二代测序（mNGS）及基因芯片技术是目前应用较为广泛的方法，可同时检测多位点、多基因、多病原［17-18］，具有快速、准确、低成本的优点，特别适用于病原体的高通量检测，在病原体的筛查与检测方面发挥了重要作用［19-20］。但mNGS检测费用昂贵，且所包含病原微生物种类繁多，临床判读结果较难，故一般不作为常规的病原体检测手段。本研究采用的基因芯片法一次性可检测34种临床常见的呼吸道病原体，检测费用较低，性价比较高，且结果易判读，基本能满足临床需要。本研究中，BALF基因芯片法病原体检测的总阳性率为96.4%，其中病毒感染占65.2%，单独病毒感染占11.7%，病毒合并其他病原感染占53.5%，细菌感染占17.8%，支原体感染占16.4%，提示难治性肺炎患儿可能多合并有病毒感染，这有助于减少不必要的抗菌药物使用及升级。从病原体分布情况看，病毒是导致1岁以内患儿感染的主要病原体，特别是RSV、Pinf及ADV。MP和SP是导致3~7岁患儿感染最常见的病原，而对于1~3岁患儿，病毒、细菌及支原体均易感。值得注意的是，在1岁以内难治性肺炎患儿中，BP检出高达30例次，提示近年来百日咳疫情可能在回升，应加强百日咳的监测及预防接种，这与文献报道一致［21］。本研究还发现，难治性肺炎患儿检出2种及2种以上病原体者占85.3%，提示难治性肺炎患儿大部分均为混合感染，且混合感染的情况较复杂，病毒与病毒、病毒与细菌、病毒与支原体、细菌与支原体等混合感染的情况均可出现，甚至出现病毒、细菌与支原体的多重混合感染，且各种混合感染所占的比例相差不大，为临床治疗增加了难度。故难治性肺炎抗感染药物的选择难度较大，病原体检测结果对于指导抗感染药物的选择显得尤为重要。本研究中，500例难治性肺炎患儿在BALF基因芯片法病原学检测结果的指导下及时调整了抗感染治疗，均取得了良好的治疗效果，出院时临床症状、体征均明显好转，复查胸部影像学病灶也明显吸收。另外，本研究中，BALF基因芯片法细菌检测阳性率最高，与痰培养及BALF细菌培养阳性率比较，差异均有统计学意义。而且基因芯片法不仅覆盖了常见的细菌，还覆盖了常见的病毒和非典型病原，检测范围更广，在临床上更具优势。综上所述，BALF基因芯片法病原学检测不仅价格适中，且一次性能检测临床常见的病原微生物，为难治性肺炎患儿提供了有力的病原学依据，是一种针对难治性肺炎患儿病原检测非常有效的措施。但基因芯片法也有不足之处，其只能提供病原体结果，不能提供药敏试验信息。总之，对于经验性治疗病情迁延不愈、效果不佳的患儿，早期行BALF基因芯片法病原学检测，有助于指导临床抗感染药物的选择，并有利于抗菌药物的合理使用。
参考文献略
本文编辑：臧赫
数字编辑：郑成铭
制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部
《中华实用儿科临床杂志》
面向临床
突出实用
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