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作者：李慧敏 康美云 薛瑶 王娅萍 张姮 戎留成 黄婕 方拥军通信作者：方拥军，Email:fyj322@189.cn作者单位：南京医科大学附属儿童医院血液肿瘤科，南京 210008本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2023,38(5):348-351.引用本文：李慧敏,康美云,薛瑶,等.二代测序技术检测儿童急性B淋巴细胞白血病IGH/IGK基因克隆性重排微小残留病的临床意义[J].中华实用儿科临床杂志,2023,38(5):348-351.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20220729-00915.
摘要
目的 与流式细胞术（FCM）比较，评价基于IGH/IGK 基因克隆性重排的二代测序技术（NGS）在检测儿童急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）微小残留病（MRD）中的临床意义。方法 回顾性分析南京医科大学附属儿童医院2019年7月至2021年7月诊断的85例B-ALL患儿的临床信息、初诊及诱导治疗后骨髓NGS-MRD 与FCM-MRD结果，采用χ2检验或Fisher′s精确概率法比较2种方法的灵敏性和阳性率，并采用Spearman相关分析比较两者的相关性。结果 初诊时患儿通过NGS方法均检测到优势克隆序列，75例（88.2%）通过FCM方法找到筛选标记。诱导治疗后，同一时间点NGS-MRD与FCM-MRD阳性率分别为31.8%（27/85）和9.4%（8/85），差异有统计学意义（P<0.001）。与FCM相比，NGS方法具有良好的灵敏度（100.0%）、特异度（75.3%）及阴性预测值（100.0%），阳性预测值为29.6%。NGS-MRD定量结果与FCM-MRD具有良好的相关性(r=0.569，P<0.001)。截至2022年7月27日，2例NGS-MRD（+）FCM-MRD（-）患儿在维持治疗期间出现复发。结论 NGS与FCM用于检测B-ALL患儿MRD具有较高一致性。与FCM相比，NGS在灵敏性方面具有显著优势。将NGS与FCM两种方式相结合用于监测B-ALL患儿诱导治疗后骨髓MRD，能让他们更大程度获益。
关键词
二代测序；急性淋巴细胞白血病；微小残留病；流式细胞术
急性淋巴细胞白血病(ALL)是儿童最常见的恶性肿瘤［1］，包括T-ALL、B-ALL及混合表型。其中，B-ALL约占儿童ALL的85%［2］。微小残留病（MRD）是患儿完全缓解后体内仍残存的少量肿瘤细胞，是ALL复发的主要根源［1,3-6］。目前，检测MRD可应用流式细胞术（FCM）、实时荧光定量聚合酶链反应（RQ-PCR）和二代测序技术（NGS）等方法［1,7］。FCM检测MRD有其局限性。例如，部分患儿白血病细胞表面未能找到异常免疫表型 (LAIPs)；化疗后白血病细胞的免疫表型可能发生变化，出现假阴性结果。而RQ-PCR适用范围较小，费时费力，难以准确判断MRD［1］。本研究采用NGS方法识别、量化B-ALL患儿骨髓DNA中的IGH、IGK受体基因的疾病相关重排序列［8］，比较患儿诱导治疗后骨髓FCM-MRD和NGS-MRD结果，探讨NGS检测B-ALL患儿MRD的临床意义。
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资料与方法1.1 一般资料 回顾性研究。研究对象为2019年7月至2021年7月在南京医科大学附属儿童医院血液肿瘤科诊断为B-ALL、接受规范化疗并在诱导治疗后同时通过NGS与FCM两种方法检测MRD的所有患儿。依据2016年世界卫生组织(WHO)髓系肿瘤和急性白血病分类修订版诊断B-ALL［9］。研究对象纳入标准如下：（1）符合B-ALL诊断标准；（2）年龄<18周岁；（3）初诊初治患儿；（4）与监护人充分沟通并获得同意，同时签署知情同意书；8岁以上患儿告知本人，并签署知情同意书。排除标准如下：（1）既往接受过抗白血病治疗；（2）合并其他恶性肿瘤；（3）存在活动性或难以控制的感染，如乙型肝炎、丙型肝炎或人类免疫缺陷病毒（HIV）感染等；（4）存在难以控制的自身免疫病和免疫缺陷。本研究通过南京医科大学附属儿童医院医学伦理委员会批准（批准文号：202204024-1）。本研究收集并分析了患儿的临床信息，包括性别、初诊年龄、白细胞计数、分子遗传学特征等，并在初诊及治疗过程中对患儿进行骨髓穿刺，通过FCM和NGS两种方法检测骨髓MRD。末次随访时间为2022年7月27日。1.2 FCM-MRD与数据分析 初诊时，采集患儿乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝骨髓标本。利用BD Canto Plus流式细胞仪确定患儿骨髓LAIPs，如CD38、CD24、CD73、CD58、CD86、CD123、CD66c、CD200、CD81、NG2、CD133等。未能找到筛选标记者，应用简易抗体组合［10］。诱导治疗后再次采集患儿骨髓标本，根据标记的LAIPs，使用FCM计数骨髓样本中残存的白血病细胞，其占骨髓单个核细胞（MNC）总数的比例即MRD的数值。FCM-MRD阳性是指每一万个骨髓MNC中含有至少一个白血病细胞（≥0.01%）。1.3 NGS-MRD与数据分析 初诊时，采集患儿EDTA抗凝骨髓液。后续检测MRD委托江苏先声医学诊断有限公司完成，具体过程如下：（1）提取骨髓液DNA并测定浓度、纯度及完整性。（2）文库构建：采用多重扩增法构建完整文库，即设计特异性引物，多重PCR扩增目的区域片段。（3）文库定量：初步定量扩增纯化后的终文库，检测文库片段大小。（4）上机测序：文库浓度及片段符合预期要求后应用Illumina测序平台测序。边合成边测序，在测序仪器中加入4种荧光标记的脱氧核糖核苷酸（dNTP）、DNA聚合酶及引物进行扩增。测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP即释放出相应的荧光。测序仪捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息，并对数据进行分析。本研究主要检测B-ALL患儿骨髓样本中IGH基因的可变区（V）、多变区（D）、连接区（J）及IGK的V、J区，包括：IGH VH-FR2、IGH VH-FR3、IGH DH-JH、IGK Vk-Jk/Kde（优势克隆序列指占比≥5%的序列，即克隆序列的有效测序读数与样本中有效测序总数的比值≥5%）。缓解后，采集并提取骨髓DNA（DNA提取量≥6.6 μg），测定优势克隆序列的丰度，计算白血病细胞占有核细胞的比值以评估MRD［8,11-12］。NGS-MRD阳性是指每百万个骨髓有核细胞中含有至少一个白血病细胞（≥0.000 1%）。1.4 统计学处理 采用SPSS 25.0进行统计学分析。计数资料以例数（%）表示，组间率的比较采用χ2检验或Fisher′s精确概率法。通过Spearman相关分析比较NGS-MRD与FCM-MRD之间的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。
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结果2.1 患儿的基本特征 本研究对符合纳入标准的85例B-ALL患儿进行了分析。其中，男55例，女30例，中位年龄为3.8岁。临床信息见表1。患儿初诊及诱导治疗后骨髓DNA提取量均满足要求。
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讨论研究表明，诱导治疗后ALL患儿骨髓MRD水平与其预后之间存在显著相关性［13］。MRD逐渐成为白血病分层诊疗的重要组成部分。定量分析MRD水平有助于评估白血病细胞对于化疗药物的敏感性，从而指导治疗。因此选择敏感的方法定期监测治疗过程中的骨髓MRD水平，并据此及时调整治疗方案非常重要。如前文所述，目前广泛使用的FCM及RQ-PCR技术用于检测MRD均存在一定的局限性，而检测IGH/IGK克隆重排的NGS技术克服了相应弊端，可达到更深的测序深度，敏感性更高，可定量检测10-7至10-5水平的MRD细胞，且适用于大多数ALL患儿，样本需求量小，检测过程高度自动化［3,8,14］。目前，NGS方法已被美国国立综合癌症网络（NCCN）及国内诊疗规范推荐用于检测ALL患儿MRD［1,15-16］。B淋巴细胞Ig基因V区、D区和J区各片段之间重新排列组合，产生了高度多样化的序列，因而可作为B淋巴细胞的克隆基因标志物［17］。正常情况下，Ig重排的多样性导致其功能的多样性；而在相关因素刺激下，Ig进行选择性重排，呈现淋巴细胞克隆性增殖。基于此，本研究中使用基于IGH/IGK基因克隆性重排的NGS技术检测骨髓MRD。初诊时通过一组特殊设计的引物组合对IGH和IGK重排区域进行捕获，建库后上机进行高通量测序，通过生物信息学分析明确优势克隆。诱导治疗后依据初诊检测结果，针对性地分析特异性的单克隆序列以检测残留白血病细胞［17］。本研究将NGS-MRD方法与FCM-MRD方法进行了比较。FCM检测MRD主要是通过多参数定量分析来识别白血病细胞表面的异常免疫表型，而部分患儿白血病细胞表面无异常免疫表型，因而无法找到检测标记。本研究中，10例患儿出现此类情况，而他们通过NGS均检测到优势克隆序列。因此对于这部分患儿，NGS检测IGH/IGK基因克隆性重排微小残留可作为很好的补充。在诱导治疗后，85例患儿均在同一时间点通过两种方法检测骨髓中残留的白血病细胞，66例（77.6%）骨髓MRD的定性检测结果是一致的，结果具有较高一致性。NGS-MRD （31.8%）阳性检出率明显高于FCM-MRD （9.4%）；与FCM相比，NGS方法具有较高的灵敏性、特异性及阴性预测值。联合应用两种方法监测MRD，可避免潜在的假阴性结果。另外，NGS的高灵敏度使其能更及时准确地预测B-ALL复发，用于诱导治疗后动态监测疾病进展。Cheng等［18］对32例成人B-ALL患者进行回顾性研究，发现在深度缓解的患者中，NGS-MRD转阳远早于FCM-MRD 转阳；且在严密监测NGS-MRD的情况下，NGS-MRD 转阳可比临床复发早25.6周。本研究中，2例诱导治疗后NGS-MRD（+）FCM-MRD（-）患儿在维持治疗期间出现复发。例1为4岁女童，存在KRAS突变及BTG1基因EXON2大片段杂合缺失，予CCCG-ALL-2015中危组方案化疗。第19天骨髓FCM-MRD为0.06%，第46天为<0.01%。在确诊13个月及15个月NGS-MRD转阳，结果分别为1.83×10-6和1.84×10-6，而2次FCM-MRD结果仍为阴性，因此缩短了检测间隔时间。6个月后通过FCM方法亦检测到MRD转阳，结果为19.03%，目前正接受嵌合抗原受体T淋巴细胞免疫疗法（Car-T）治疗。此例NGS比FCM提前8个月检测到转阳情况。例2为4月龄女童，第46天及确诊5个月时NGS-MRD分别为4.87×10-5及1.27×10-5，FCM-MRD均为阴性。后续定期监测MRD，在确诊17个月后FCM-MRD阳性，为8.02%。本研究认为，NGS-MRD阴性提示当前患儿骨髓达深度缓解，但仍需定期监测残留水平；在深度缓解之后，FCM-MRD 阴性而NGS-MRD转阳的患儿，可能处于复发早期，残留水平可能继续升高，因此需要全面评估患儿病情，缩短MRD监测时间，及早发现并处理复发情况。本研究的局限性在于研究病例相对较少，缺乏临床结局的长期随访。作者将进一步扩大样本，规范检测时间点，并对所有患儿追踪随访，以进一步探讨NGS检测IGH/IGK基因克隆性重排MRD状态与预后的相关性及对治疗的指导意义。作者贡献声明：李慧敏：采集并分析数据、起草文章；康美云：酝酿和设计试验、统计分析、对文章的知识性内容作批评性审阅；薛瑶、王娅萍：实施研究、分析/解释数据；张姮、戎留成、黄婕：实施研究、支持性贡献；方拥军：酝酿和设计试验、对文章的知识性内容作批评性审阅、提供指导及行政、技术或材料支持
参考文献略
本文编辑：单卫华
数字编辑：郑成铭
制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部
《中华实用儿科临床杂志》
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