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作者：史大伟1 刘玲2 赵萌萌3 叶乐平3 周薇2 郭东星4 李丹4 窦海伟4 涂鹏4 宛瑞杰4 辛德莉4通信作者：辛德莉，Email：xindl48@126．com作者单位：1首都医科大学附属北京友谊医院儿科，北京 100050;2北京大学第三医院儿科，北京 100191；3北京大学第一医院儿科，北京 100034；4首都医科大学附属北京友谊医院，北京热带医学研究所，北京 100050本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(12):893-896.引用本文：史大伟,刘玲,赵萌萌,等.肺炎支原体肺炎患儿支气管肺泡灌洗液中肺炎支原体耐药基因和13种病原检测结果分析[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(12):893-896.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20210716-00833.
摘要
目的 了解肺炎支原体肺炎(MPP)患儿支气管肺泡灌洗液(BALF)中肺炎支原体（MP）耐药基因和13种呼吸道病原的分布情况。方法 回顾性选择2018年1月至2019年1月北京大学第三医院和北京大学第一医院 100例MPP患儿的BALF标本，采用荧光定量PCR法检测MP核酸及其耐药基因，采用多重PCR核酸检测技术测定甲型流感病毒、甲型流感病毒H1N1、甲型流感病毒H3N2、乙型流感病毒、人副流感病毒、腺病毒、人博卡病毒、人鼻病毒、肺炎衣原体、人偏肺病毒、MP、人冠状病毒和呼吸道合胞病毒核酸，采用χ2检验进行分析。结果 100例BALF标本，荧光定量PCR法检测MP及耐药基因，83例（83.00%）MP阳性，其中78例（93.98%）耐药，均为23S rRNA结构域V区A2063G的点突变。多重PCR法检测13种呼吸道病原，89例（89.00%）阳性。79例（79.00%）检测到MP，其中74例（74.00%）仅检出MP，5例（5.00%）同时检出MP合并其他病原。10例（10.00%）检测出其他病原。0~4岁组病毒检出率高于>4~6岁组（P=0.042）和>6岁组（P=0.002），差异均有统计学意义。结论 MPP患儿的BALF标本绝大部分可检测到MP，耐药现象严重，以A2063G的点突变为主。少数BALF标本中可检测到其他呼吸道病原和2种或3种病原。
关键词
肺炎支原体；支气管肺泡灌洗液；耐药；混合感染
肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae,MP）是引起儿童社区获得性肺炎（community acquired pneumoniae,CAP）的重要病原，占住院儿童CAP的10％~40％［1］。近年来重症肺炎支原体肺炎（severe Mycoplasma pneumoniae pneumonia,SMMP）和难治性肺炎支原体肺炎（refractory Mycoplasma pneumoniae pneumonia，RMPP）不断增多，对儿童危害严重。MP对大环内酯类抗生素耐药或合并其他病原感染，可导致病情加重、迁延，是引起SMMP和RMMP的重要原因［2-4］。支气管肺泡灌洗液(BALF)作为病原检测标本可更客观、准确地反映下呼吸道的病原情况。本研究采用荧光定量PCR法检测肺炎支原体肺炎(MPP)患儿BLAF标本MP核酸及其耐药基因，同时采用多重PCR核酸检测技术检测13种常见呼吸道病原核酸，了解MPP患儿MP的耐药情况及BALF标本中常见呼吸道病原的分布情况，为临床诊断和治疗提供参考。
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资料与方法1.1 研究对象 回顾性选取2018年1月至2019年1月北京大学第三医院、北京大学第一医院临床确诊MPP并接受纤维支气管镜治疗患儿的BALF标本，诊断标准参考《儿童肺炎支原体肺炎诊治专家共识(2015年版)》［1］及《诸福棠实用儿科学》第8版［5］。本研究通过首都医科大学附属北京友谊医院医学伦理委员会批准(批准文号：2019-P2-176-02)，入组病例均由患儿监护人和患儿本人(≥8岁)共同签署知情同意书。1.2 方法 1.2.1 BALF采集 按照电子支气管镜操作规范留取BALF标本［6］，分装后于-80 ℃冰箱中保存。1.2.2 核酸提取 采用核酸提取或纯化试剂 BD-Micro型（宁波市重鼎生物技术有限公司，批号：20190212），按照试剂盒说明书提取既往保存BALF标本的核酸。PCR仪购自美国ABI公司。1.3 荧光PCR法检测MP及其耐药基因 应用荧光定量PCR扩增呼吸道标本MP的23S rRNA基因，PCR产物应用直接测序法测序测得序列与美国国家生物技术信息中心（NCBI）已登录的标准株 23S rRNA基因作比对［7］。1.4 多病原检测 多重PCR核酸检测试剂盒由宁波海尔施基因科技有限公司提供（生产批号：109103001）。包括甲型流感病毒(InfA）、甲型流感病毒H1N1（H1N1）、甲型流感病毒H3N2（H3N2）、乙型流感病毒（InfB）、人副流感病毒（HPIV）、腺病毒（ADV）、人博卡病毒（HBoV）、人鼻病毒（HRV）、肺炎衣原体（CP）、人偏肺病毒（HMPV）、肺炎支原体（MP）、人冠状病毒（HCoV）和呼吸道合胞病毒（RSV）。操作过程按说明书执行。1.5 统计学处理 应用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
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结果2.1 一般资料 共收集到100例MPP患儿的BALF标本。其中男47例（47.0%），女53例（53.0%）；0~4岁组13例，>4~6岁组35例，>6岁组52例。2.2 荧光定量PCR法检测MP及其耐药基因结果 100例患儿BALF标本中，83例（83.00%）MP阳性，其中78例（93.98%）存在耐药基因点突变，均为23S rRNA结构域V区A2063G的点突变。0~3岁组MP的阳性率为 61.54%(8/13例)，耐药率为100.00%（8/8例）；4~6岁组MP阳性率为80.00%(28/35例)，耐药率为89.29%（25/28例）；>6岁组MP阳性率为90.38%（47/52例），耐药率为95.74%（45/47例）。各组耐药率比较差异无统计学意义（χ2=1.897，P=0.168）。2.3 多重PCR呼吸道病原检测结果 100例患儿BALF标本中，89例（89.00%）可检测到病原。病原阳性标本中，79例（79.00%）检测到MP，其中74例（74.00%）标本仅检出MP，5例（5.0%）标本同时检出其他病原（分别为MP+RSV+HPIV、MP+HRV、MP+ HCoV、MP+ HMPV、MP+ InfA）；10例(10.00%)标本检测出其他病原，其中4例（4.00%）检出RSV；2例(2.00%)检出ADV；1例(1.00%)检出HRV；1例(1.00%)检出CP；1例(1.00%)检出HPIV和HCoV；1例(1.00%)检出InfA和HBoV（表1）。不同年龄组MP检出率（包括单纯MP感染和MP混合病毒感染）分别为0~4岁组61.54%(8/13例)，>4~6岁组77.14% (27/35例)，>6岁组84.62% (44/52例)，各组间比较差异无统计学意义（χ2=3.450，P=0.178）。不同年龄组病毒检出率分别为0~4岁组38.46%(5/13例)，>4~6岁组8.57% (3/35例)，>6岁组3.85%(2/52例)，0~4岁组病毒检出率高于>4~6岁组（χ2=4.135，P=0.042）和>6岁组（χ2=9.616，P=0.002）。
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讨论MP是儿童CAP的重要病原，对MPP病原学检测的标本主要是鼻咽拭子、痰和BALF。不同标本来源对MP的检出率和价值不同，BALF直接取材于病变部位，可更客观、准确地反映下呼吸道的病原情况。张新星等［8］比较CAP儿童鼻咽抽吸物和BALF病原分析发现BALF中MP检出率高于鼻咽抽吸物。章爱莲等［9］对40例肺炎患儿的咽拭子及BALF标本进行MP荧光PCR检测，咽拭子阳性率为27.5％，BALF阳性率为50.0％。BALF作为检测标本，能更准确地反映MPP患儿肺内的病原情况。本研究对MPP患儿BALF标本进行MP检测，绝大部分可检测到MP核酸，对肺部感染炎症的病原学判定更有意义。2001年日本报道从临床分离到MP耐药株，我国2003年分离到MP耐药株，后续许多国家和地区也报道了MP耐药情况［10-11］。目前认为23S rRNA耐药突变是MP对大环内酯类药物耐药的主要机制，A2063G突变是最为常见突变位点。我国自发现MP耐药以来，耐药率处于较高水平。Zhao等［12］报道2008年至2012年北京地区MP耐药检出率分别为68.9%、90.0%、98.4%、95.4%和97.0%,其中97.1%为A2063G的点突变，2.5%为A2064G的点突变，0.4%为A2063T的点突变。Dou等［13］报道2016年北京地区儿童MP耐药检出率为66%，其中93.84%为A2063G的点突变，6.16%为A2064G的点突变。Zhou等［4］对上海地区107例MPP患儿的咽拭子和痰标本进行MP耐药基因检测，耐药率为56.07%（60/107例），均为A2063G的点突变，RMPP组患儿的耐药率（71.43%）高于普通MPP组（39.22%）。张伟利等［14］对2013年10月至2014年9月江苏地区82例MPP患儿的呼吸道标本进行检测，耐药率为90.2%（74/82例），均为A2063G的点突变，结合病情发现，相较于耐药MPP组，敏感MPP组患儿发热时间更短，糖皮质激素的应用更少。本研究中入组患儿因病情需要均接受纤维支气管镜治疗，应用荧光定量PCR检测BALF标本中的MP耐药基因，耐药率为93.98%（78/83例），且均为23S rRNA结构域V区A2063G的点突变，与文献［14］报道相似，提示MP耐药可能是导致MPP病情加重的一个因素。但研究中有5例患儿未检测到MP耐药基因的点突变，提示MP耐药并非MPP患儿病情加重的唯一因素，需进一步分析混合感染、机体免疫应答等因素对MPP患儿病情的影响。在临床工作中，应注意MP耐药的情况，积极完善MP耐药基因检测，以明确病因，合理用药。MP可与细菌、病毒或其他病原体同时感染。由于标本来源、病原学检测方法以及病原体检测范围不同，文献中报道的混合发生率和病原体不尽相同［3-4,15］。文献报道MPP混合其他病原微生物感染检出率为13.60%～56.07%，混合感染病原体有细菌、病毒和其他病原微生物，其中MP混合病毒感染的检出率为9.8%～33.3%。陈玲玲等［3］报道201例MPP患儿中103例（51.2%）混合其他病原感染，其中CP抗体阳性52例（25.9%）、痰标本呼吸道病毒抗原阳性29例（14.4%），痰或BLAF标本细菌定量培养阳性22例（10.9%），混合感染患儿的住院时间更长，胸腔积液发生率更高。Zhou等［4］对107例MPP患儿的咽拭子和痰标本进行多病原核酸检测，其中60例（56.07%）合并病毒感染，腺病毒24例（22.43%）最常见，RMPP组患儿的腺病毒检出率（32.14%）高于普通MPP组（11.76%）。Zhao等［15］对60例RMPP患儿的BALF标本进行细菌培养和呼吸道病原核酸检测，合并病毒感染率为33.3%，合并细菌感染率为5%。本研究以MPP患儿的BALF为检测标本，可更为准确地反映MPP患儿肺内的病原情况。本研究中10例（10.00%）MPP患儿的BALF标本仅检测到呼吸道病毒或CP，5例（5.00%）检出MP和其他病毒同时存在，提示临床中应注意MPP患儿与常见呼吸道病毒及CP的混合感染；11例（11.00%）未检测出MP核酸，也未检测出其他呼吸道病原核酸，考虑与入组患儿的病情和标本来源有关，与检测的13种病原为呼吸道常见病毒、MP和CP，未覆盖细菌等有关。综上所述，本研究中入组MPP患儿的BALF标本大部分可检测到MP，MP耐药率高，以A2063G的点突变为主，临床应重视MP耐药情况；部分标本同时检测到其他呼吸道病原和2种或3种病原微生物核酸。对MPP患儿尤其是RMPP和SMPP患儿的BALF标本开展MP耐药和多病原检测，能反映MP的耐药情况和混合感染情况，对指导临床合理用药有意义。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
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