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作者：陈佳怡 张晗 尚云晓通信作者：尚云晓，Email：shangyunx@sina.com作者单位：中国医科大学附属盛京医院小儿呼吸内科，沈阳 110004本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(12):897-902.引用本文：陈佳怡,张晗,尚云晓.肺炎支原体肺炎支气管肺泡灌洗液中23S rRNA耐药基因阳性患儿的临床及支气管镜下特点[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(12):897-902.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20210723-00869.
摘要
目的 探讨肺炎支原体肺炎支气管肺泡灌洗液（BALF）中23S rRNA耐药基因阳性患儿的临床及支气管镜下特点，发现能够早期识别肺炎支原体耐药性的临床指标。方法 回顾性分析中国医科大学附属盛京医院小儿呼吸内科2017年10月至2018年6月确诊为肺炎支原体肺炎的61例住院患儿的临床资料，对其进行纤维支气管镜检查，并留取BALF，检测BALF中23S rRNA V区基因的2063位点突变情况，分为耐药基因阳性组和耐药基因阴性组，比较不同组别患儿的临床表现、相关实验室数据、影像学资料、纤维支气管镜的镜下表现。采用t检验、秩和检验、χ2检验、Fisher′s确切概率法、多因素Logistic回归分析等统计学方法对数据进行分析。结果 61例患儿中耐药基因阳性组38例(62.30%)，耐药基因阴性组23例(37.70%)。2组患儿性别及年龄差异均无统计学意义(均P>0.05)。耐药基因阳性患儿的住院天数及发热时间长于耐药基因阴性组，更容易出现难治性肺炎支原体肺炎（RMPP）及肺外并发症，差异有统计学意义(P<0.05)，低氧血症差异无统计学意义(P>0.05)。2组患儿白细胞（WBC）、C反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）、D-二聚体（D-D）、白细胞介素6（IL-6）比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。除耐药基因阳性组WBC水平低于耐药基因阴性组，其余实验室检查结果耐药基因阳性组均高于耐药基因阴性组；血清乳酸脱氢酶（LDH）及BALF中IL-6水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。对几种有统计学意义的实验室指标进行Logistic回归分析，发现WBC识别耐药基因的敏感性更高，最佳临界值为8.55×109/L，D-D识别耐药基因的特异性更高，最佳临界值为523 μg/L。耐药基因阳性组中35例（92.11%）影像学表现为大面积肺实变/肺不张，耐药基因阴性组为13例（56.52%），差异有统计学意义(P<0.05)。耐药基因阳性组主要表现为黏膜糜烂、坏死，痰栓/塑型性痰栓及支气管炎性狭窄［19例（50.00%）］，耐药基因阴性组以黏膜纵行皱襞、絮状及黏性分泌物表现为主［14例（60.88%）］，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 23S rRNA V区基因发生点突变与肺炎支原体肺炎患儿的临床特征密切相关，发生A2063G突变的患儿更容易发生RMPP及肺外并发症，影像学和支气管镜下表现更重。血液中WBC及D-D水平的高低对早期识别耐药性具有一定意义，耐药基因阳性的肺炎支原体肺炎引起的全身过度免疫炎症反应需要引起重视。
关键词
肺炎支原体；耐药基因；肺炎支原体肺炎，难治性；支气管肺泡灌洗液
肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae,MP）是儿童呼吸道感染最常见的病原体之一，也是引起社区获得性肺炎的重要病原［1-3］。儿童MP每间隔3～7年会呈现局部暴发流行的趋势，发病率逐年上升［4］。MP肺炎患者在大环内酯类抗菌药物规范治疗1周或1周以上，其临床症状、体征或肺部影像学表现无好转，甚至病情加重或迁延不愈，则称为难治性MP肺炎（RMPP）［5］，而RMPP 可能会引起许多并发症［6］，严重影响患儿的临床预后。大环内酯类药物是治疗儿童MP肺炎的首选药物。近年来，耐药现象不断出现且逐渐加重，重症或难治MP肺炎明显增多，且全世界耐药率呈现差异性，以亚洲地区多发［7］。因此，本研究对耐药基因与临床表现、相关实验室数据、影像学变化、支气管镜下表现的关系进行了研究，充分了解其特征，期待能够早期识别MP的耐药性。现将结果报道如下。
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资料与方法1.1 研究对象 本研究为回顾性分析。收集2017年10月至2018年6月中国医科大学附属盛京医院小儿呼吸内科确诊为MP肺炎并行纤维支气管镜肺泡灌洗术检查的61例住院患儿临床资料。男31例，女30例，年龄1~14 岁。根据支气管肺泡灌洗液（BALF） 中MP 23S rRNA V区基因的2063位点突变情况分为MP耐药基因阳性组38例，MP耐药基因阴性组23例。纳入标准：参照《诸福棠实用儿科学》第8版［8］MP肺炎的诊断标准，通过血清学检测MP抗体IgM阳性，或合并鼻咽拭子PCR检测MP DNA阳性。而在确诊MP肺炎的基础上应用大环内酯类抗生素1周或1周以上，临床症状仍不缓解或伴影像学加重，则为RMPP。排除标准：（1）血液细菌培养或BALF细菌培养阳性、细菌涂片阳性的患儿，或合并病毒感染、肺结核、真菌感染、支气管哮喘、支气管肺发育不良及其他肺部疾病；（2）行支气管肺泡灌洗术前曾应用糖皮质激素及免疫调节剂治疗；（3）患有先天性心脏病或同时患有免疫缺陷病的患儿，血液病或肿瘤疾病，心脏功能严重减退有心力衰竭表现者，有明显的心律失常以及不能配合完成支气管肺泡灌洗术的患儿。纳入研究的患儿临床症状及影像学表现均符合纤维支气管镜肺泡灌洗术的指征［9］，本研究通过医院医学伦理委员会批准（批准文号：2016PS251K），并征得患儿监护人知情同意。1.2 研究方法1.2.1 BALF中MP耐药基因检测 留取BALF后将其储存于-80 ℃冰箱待测，参考既往报道［10-11］对23S rRNA V区的引物序列进行扩增，由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。上游引物：5′-GGGGAAGAGCCCAGAT-3′，下游引物：5′-GTCCAGGAAACCTTAGTCAA-3′。PCR循环条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；72 ℃终延伸5 min；反应结束后取5 μL反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。最后确定23S rRNA V区2063位点基因型。1.2.2 BALF中白细胞介素6（IL-6）检测 采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）测定IL-6水平，由上海酶联生物科技有限公司提供，过程严格按说明书操作。根据病史资料，记录以下指标：性别、年龄、发热持续时间、住院天数、有无低氧血症、是否合并肺外并发症、实验室常规检查、影像学结果、纤维支气管镜镜下表现等。1.3 统计学处理 使用SPSS 22.0统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料以x̄±s表示，组间比较采用t检验；非正态分布的计量资料以M(P25,P75)表示，组间比较采用秩和检验；计数资料用率表示，率的比较采用χ2检验，理论频数<5或总例数<40用Fisher′s确切概率法。P<0.05为差异有统计学意义。对差异有统计学意义的自变量进行多因素Logistic回归分析。
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结果2.1 一般资料 本研究共收集61例患儿，其中男31例(50.82％)，女30例(49.18％)。根据BALF中MP 23S rRNA V区基因的2063位点突变情况分为MP耐药基因阳性组38例(62.30%)，MP耐药基因阴性组23例(37.70%)。患儿性别及年龄差异均无统计学意义(均P>0.05)(表1)。
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讨论MP是引起儿童非典型肺炎最常见的病原体［12］，MP感染轻者能出现自限性的上呼吸道感染症状，严重者可以导致发生肺外并发症的重症MP肺炎［13］，甚至危及生命［14］。研究表明，在治疗RMPP早期使用支气管镜肺泡灌洗有助于缩短病程并促进肺部影像学好转，改善临床预后， BALF来源于远端气道及肺泡组织，能够直接反映局部炎症及病原活动情况［15］。国内外将耐药机制的研究热点集中23S rRNA V区基因点突变，其中以2063位点发生A→G最为常见，突变率高达98%以上［16-17］，提示了MP对大环内酯类抗生素的耐药性［18］，推测其与RMPP相关［19］。机体对病原体的过度免疫反应在RMPP的发生中起重要作用，由单核/巨噬细胞、T淋巴细胞等产生的细胞因子如IL-6具有多种生物活性，已有研究证明IL-6与RMPP密切相关［20］，这可能与其促进炎症反应的作用有关。RMPP发热、咳嗽时间长，病情进展迅速，可出现气促、喘息、胸闷、低氧血症甚至呼吸衰竭等表现，容易合并其他病原体感染，短时间内肺部影像学可以出现大面积肺部实变、胸腔积液、肺组织坏死、肺脓肿、气胸等，远期造成支气管扩张、闭塞性支气管炎等疾病，严重影响患儿的生活质量。RMPP较普通MP肺炎更容易出现肺外系统受累，如血液系统、中枢神经系统、消化系统、泌尿系统及皮肤等，甚至出现全身炎症反应综合征［21-22］，可见RMPP对儿童的危害极大，而支气管肺泡灌洗术常作为有效的治疗手段。由于RMPP临床表现多样，容易造成漏诊等后果导致病情进行性加重，因此各种用来在疾病早期预测RMPP严重程度的临床标志物引起了学者们的广泛关注。目前认为RMPP的发病原因包括MP对大环内酯类抗生素的耐药、过度的免疫炎症反应、合并其他病原体感染等［23］。大环内酯类抗生素可以有效治愈MP感染［24-25］。研究表明，MP对大环内酯类药物的耐药率的地区差异性与大环内酯类药物使用频率密切相关［26］。已有多位学者证明耐大环内酯类药物的MP常在23S rRNA 基因V区发生A2063G突变，且在RMPP中产生耐药的比例要远远高于普通型MP肺炎，重症比例增加［19，27-28］。本研究发现在38例耐药基因阳性患儿中有28例（73.68%）为RMPP，23例耐药基因阴性患儿中有7例（30.43%），差异有统计学意义，推测耐药基因阳性与RMPP具有一定的相关性。本研究发现，2组患儿的年龄、性别无明显差异，而耐药基因阳性组的发热时间及住院天数较耐药基因阴性组更长，肺外并发症的发生率更高，这与其他研究得出的结论相同［27,29］。感染性疾病临床表现的严重程度可以用病原体及机体的平衡关系解释，过度的炎症反应可能导致细胞因子释放和免疫紊乱［30］。有研究表明［31］，23S rRNA V区2063位点基因型发生突变可能影响DNA载量的变化，局部MP-DNA载量能够客观反映病原与机体免疫清除能力之间的平衡，耐药组MP-DNA载量高于非耐药组，而MP可以通过其毒素或代谢产物直接损伤呼吸道上皮，也可以引起全身过度炎症反应，这可能是导致耐药基因阳性组患儿发生肺外并发症更多的原因之一，而免疫状态的改变是否能够诱发耐药株基因突变还有待研究。已有研究表明［28］，耐药性MP肺炎较非耐药性MP肺炎发生低氧血症及呼吸困难更多，但本研究结果提示2组患儿发生低氧血症无明显差异性，这可能与研究标本量过少有关。结合既往大量研究，可见耐药性MP肺炎对儿童危害极大，因此尽早识别MP耐药性并制定适当、合理的治疗方案非常重要。本研究收集了临床中常见的非特异性化验指标，发现与耐药基因阴性组相比，耐药基因阳性组的CRP、PCT、D-D、血清IL-6水平更高，而WBC水平较低，并对以上指标进行Logistic回归分析，WBC和D-D的水平与耐药基因阳性有相关性，对MP耐药性的早期识别具有一定的参考意义，而2组BALF中IL-6水平比较差异无统计学意义，说明代表局部病灶炎症反应的BALF中IL-6水平对预测MP耐药性无意义，提示耐药性MP肺炎引起的全身过度免疫炎症反应更需要引起广泛关注。本研究还发现，耐药基因阳性组35例（92.11%）表现为大面积肺实变/肺不张，其中有10例伴胸腔积液，1例伴支气管狭窄/阻塞，1例伴肺组织坏死/空洞。本研究发现耐药基因阳性组较耐药基因阴性组更容易发生大面积肺实变或肺不张，与其他学者研究结果相符［32］。而将2组患儿支气管镜下表现进行比较，发现耐药基因阳性组主要表现为黏膜糜烂、坏死，痰栓/塑型性痰栓及支气管炎性狭窄，耐药基因阴性组以黏膜纵行皱襞、絮状及黏性分泌物表现为主，差异均有统计学意义，可见耐药基因阳性组的镜下表现整体重于耐药基因阴性组，说明严重的支气管镜下表现与MP耐药性具有一定的相关性，有助于指导临床更为合理的用药，缩短治疗天数，改善患儿临床预后。本试验亦存在着一定的局限性。首先，本研究仅检测了BALF中23S rRNA基因V区的2063位点，若该位点发生基因突变则认为存在耐药性，虽然在已知的基因位点中，发生A2063G突变的比例最高达99.5%以上［33］，但仍不能除外在其他位点，如2064、2067等发生变异，造成分组时存在假阴性的结果；其次本研究样本量较少，相关因素统计不足，部分结果存在偏差，且未在治疗上做相关研究，存在一定缺陷。综上，23S rRNA V区基因发生A2063G突变的MP肺炎患儿的临床表现、影像学和支气管镜下表现更重。血液中WBC及D-D水平的高低对早期识别耐药基因具有一定意义，耐药基因阳性的MP肺炎引起的全身过度免疫炎症反应需要引起重视。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
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