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作者：程继文1 赵璞2 余巧玲3 惠军朋4 高亚1 李鹏1通信作者：李鹏，Email:sienafiat@mail.xjtu.edu.cn作者单位：1西安交通大学第二附属医院小儿外科，西安 710004；2陕西省人民医院新生儿科，西安 710068；3西安交通大学第二附属医院病理科，西安 710004；4西安交通大学附属儿童医院病理科，西安 710003本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(10):748-753.引用本文：程继文,赵璞,余巧玲,等.维生素D受体在胆道闭锁患儿肝内胆管上皮细胞中的表达及意义[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(10):748-753.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20210208-00174.
摘要
目的 探讨肝内胆管上皮细胞（IBDECs）中维生素D受体（VDR）在胆道闭锁（BA）中可能发挥的作用及临床意义。方法 回顾性分析2015年1月至2019年12月在西安交通大学第二附属医院和西安交通大学附属儿童医院接受肝门空肠吻合术（Kasai术）治疗的38例BA患儿IBDECs中VDR的表达水平，免疫组织化学检测VDR在BA患儿IBDECs中的蛋白表达水平，以胆总管囊肿患儿IBDECs中VDR表达水平为对照；用Masson染色法观察肝组织纤维化程度；并分析BA患儿 IBDECs 中VDR的表达水平与手术时肝纤维化程度及Kasai术后难治性胆管炎发生率和自体肝生存时间之间的相关性。通过聚肌胞苷酸［Poly（I∶C）］模拟 dsRNA 病毒感染，体外干预人肝内胆管上皮细胞（HiBECs)，观察其对HiBECs活性和凋亡的影响及对HiBECs中VDR表达水平的影响。采用独立样本t检验比较两组样本之间的差异；采用χ2检验或Fisher′s确切概率法分析VDR与BA患儿临床病理常数的相关性；采用Kaplan-Meier生存曲线分析不同VDR表达水平组BA患儿Kasai术后自体肝生存时间的差异。结果 共38例BA患儿纳入本研究，其中23例IBDECs中VDR蛋白水平无显著降低，15例VDR蛋白水平显著降低。与IBDECs中VDR表达水平无明显降低的BA患儿相比，显著降低者肝纤维化程度更严重（P<0.001），Kasai术后发生难治性胆管炎的比率更高（P=0.017）。与对照组相比，IBDECs中VDR表达水平显著下降的BA患儿自体肝生存时间更短（P=0.030）。Poly (I∶C)可引起BA患儿HiBECs的凋亡率增加（P<0.000 1）、细胞活性降低（P<0.05）；Poly (I∶C)还可引起HiBECs培养基中炎症因子（干扰素、肿瘤坏死因子α、白细胞介素-6）分泌增加（P<0.001）。Poly (I∶C)干预可引起BA患儿HiBECs中VDR蛋白的表达水平显著下降（P<0.001）。结论 Poly (I∶C)可引起BA患儿HiBECs损伤及HiBECs中的VDR表达水平下降；IBDECs 中VDR表达水平显著下降可能是BA预后不良的标志物。
关键词
胆道闭锁；维生素D受体；预后标志物
胆道闭锁（BA）是一种发生在新生儿期波及肝内外胆管的进行性硬化性病变,并常伴有肝脏的炎性纤维化，如得不到及时有效的治疗，BA患儿多在2岁内因进行性肝纤维化、胆汁性肝硬化导致肝衰竭而死亡［1］。尽管随着Kasai手术（肝门空肠吻合术）的广泛开展，BA患儿获得了更多的生存机会，但即使成功接受Kasai手术治疗实现通畅胆汁引流的患儿，最终大部分仍会发展为肝硬化需行肝移植治疗［2］。因此，深入研究BA发生和发展过程的调控新机制，寻找诊断或预后标志物，实现早期治疗对改善BA预后有重要意义。由于维生素D受体（VDR）在肝细胞中的表达水平较低，很长一段时间里有关VDR在肝脏中的生理功能研究一直被忽视。近年来研究发现VDR在肝实质细胞中表达水平很低，主要表达在肝非实质细胞中，如肝星状细胞、肝窦内皮细胞、Kupffer细胞和胆管上皮细胞［3-4］，且低维生素D（VD）水平与慢性肝脏疾病患者发生肝纤维化密切相关［5-6］。临床上BA患儿存在广泛的25羟维生素D［25,(OH)D］缺乏。随着术后VD补充和肝功能的改善，VD缺乏有所缓解，而25,(OH)D缺乏无明显改善，提示BA患儿可能存在VD活化障碍，而该机制可能参与BA肝纤维化的发生［7］。VDR在BA发生及进展中是否发挥作用？扮演什么角色？国内外尚未见研究报道。本研究通过BA患儿肝组织标本研究VDR在BA患儿肝组织中的表达水平和可能的作用。
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资料与方法1.1 研究对象 回顾性研究。从西安交通大学第二附属医院和西安交通大学附属儿童医院病理科调取38例BA患儿肝组织蜡块，蜡块为2015年1月至2019年12月接受Kasai手术切除治疗，并经过病理证实的标本。入选患儿基本临床信息通过病案室查阅获得。本研究通过西安交通大学医学部医学伦理委员会批准（批准文号：2018-2147），患儿监护人均知情同意，并签署知情同意书。术后胆管炎的诊断标准：术后无明显其他感染原因的发热加以下：（1）临床症状如黄疸或陶土色大便的再现；和（2）血清胆红素（>2.5 mg/dL）或谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）突然升高的实验室证据；或（3）血培养阳性。难治性胆管炎定义：常规治疗3 d无效，或治疗后反复发作［8］。1.2 细胞培养与处理 人肝内胆管上皮细胞（HiBECs）购自广州吉妮欧生物科技公司。培养于DMEM/Ham′s F-12(1∶1)(DF-12)培养基中［含100 mL/L胎牛血清（FBS）、5 μg/L 表皮生长因子、0.4 mg/L琥珀酸硫氢化可的松、2 nmol/L三碘甲状腺氨酸、5 mg/L胰岛素、10 mg/L重组人肝细胞生长因子、2 nmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素］。在37 ℃含50 mL/L的二氧化碳（CO2）细胞孵育箱中培养。当HiBECs达到75%融合时，用5 mg/L聚肌胞苷酸［Poly (I∶C)］(Invitrogen,San Diego,CA,USA)处理48 h，或用10 mg/L Poly (I∶C)处理24 h，然后用不同浓度的维生素D3（VD3）处理24 h。VDR过表达载体(pcDNA3.1-VDR)和对照载体(pcDNA3.1)购自南京GenScript生物技术公司。使用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen,Carlsbad,USA)转染到HiBECs中。转染48 h后，取细胞作进一步研究。1.3 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐比色法(MTT法)检测细胞增殖 细胞以5×103个细胞/孔的密度接种于96孔板，并接受不同的处理方案。处理指定时间后，每孔避光加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL）。在37 ℃下持续4 h后，吸去旧的培养基，每孔加入 150 μL 二甲基亚砜(DMSO)，室温缓慢震荡10 min，用酶标仪(BioTek,Winooski,USA)在450 nmol/L处测定吸光度，记录结果。1.4 细胞凋亡分析 使用凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC/PI)(Becton Dickinson,USA)检测细胞凋亡，按照其说明书操作。转染或处理48 h后，HiBECs悬浮在Annexin V结合缓冲液，然后与Annexin V-FITC/PI在室温下避光孵育15 min。然后使用FC 500流式细胞仪(Beckman Coulter,USA)检测细胞凋亡率。1.5 Western blot 将收获的细胞在含蛋白酶抑制剂的蛋白提取细胞裂解缓冲液中裂解30 min，从各组 HiBECs 中提取总蛋白。提取的蛋白质使用二喹啉甲酸（BCA）分析试剂盒进行定量。蛋白质样品通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上。将膜在VDR一抗（ab32042，1∶500）和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）一抗（ab8245，1∶5 000）中4 ℃冰箱过夜。二抗孵育,超敏发光显色液凝胶成像，用凝胶成像系统（美国BIO-RAD）曝光，并使用Image J软件（NIH，Bethesda，MD，USA）进行定量。GAPDH被用作上样对照。1.6 免疫组织化学检测和评判标准 应用SP染色法，VDR (ab32042)一抗1∶200稀释。VDR阳性标准：胞核和胞质出现棕黄色颗粒。参照 Axiotis等［9］标准，根据阳性细胞在全部组织细胞中所占比例以及阳性细胞染色强度判定实验结果：A：按显色细胞数比例计分（视野里汇管区胆管上皮细胞阳性/胆管上皮细胞总数），0分（0%~10%）、1分（11%~25%）、2分（26%~50%）、3分（51%~75%）和4分（76%~100%）。B：按细胞显色深浅计分，0分(不着色)、1分(弱着色)、2分(中度着色)和3分(强着色)。具体由2名5年以上工作经验的病理科医师执行。积分数=A×B。A×B=0判断为（-），A×B=1～2判断为（+），A×B=3～4判断为（++），A×B=6～12判断为（+++）。以胆总管囊肿患儿肝内胆管上皮细胞（IBDECs）的相对表达水平为对照。1.7 肝纤维化程度评判标准 用Masson染色法观察肝组织纤维化程度。采用Chevalier（SQS）的半定量评分系统［10］评估肝纤维化程度：0～3分为轻度纤维化，4～11分为中度纤维化，12～17分为重度纤维化。1.8 随访 主要通过电话随访、返院住院及门诊复查的方式进行。截至2020年12月31日。1.9 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料比较采用两独立样本t检验。所有结果重复3次。采用χ2检验或Fisher′s确切概率法分析VDR与BA患儿临床病理常数的相关性；采用Kaplan-Meier生存曲线分析不同VDR表达水平组BA患儿Kasai术后自体肝生存时间的差异。P<0.05为差异有统计学意义。
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结果2.1 BA患儿IBDECs中VDR蛋白水平 VDR蛋白主要表达于胆管上皮细胞胞质内，呈棕褐色颗粒状，以弥漫性分布为主。以肠组织中VDR表达作为阳性对照。VDR在肝纤维化的患儿的肝细胞中均有显著表达（图1）。以先天性胆总管囊肿(CC)患儿肝内IBDECs中VDR蛋白水平为参照，纳入本研究的10例CC患儿肝内IBDECs中VDR蛋白水平免疫组织化学平均积分约为3。因此当积分数>3时定义为VDR无降低组，积分数≤2时定义为VDR显著降低组。纳入本研究中的38例BA患儿中，23例VDR正常/高表达为VDR无降低组，15例VDR显著低表达为VDR显著降低组。
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讨论VD/VDR通路在免疫平衡的维持中发挥重要作用［11］。VDR存在于人体大多数细胞中，本质上是一种配体依赖的核转录因子，其在维持机体钙-磷代谢，调节免疫和肿瘤细胞增殖、分化等方面发挥重要作用。通过动物实验发现，敲除VDR的小鼠可自发性发生肝纤维化，证实VDR对维持肝脏的正常功能是必不可少的［12］。本研究结果发现IBDECs中VDR蛋白水平与BA患儿肝纤维化程度呈负相关，肝内胆管中VDR表达水平显著降低的患儿，肝纤维化程度更严重（P<0.05）。现有研究表明，BA患儿肝纤维化程度与自体肝生存时间明显负相关［13］。BA患儿存在广泛的25,(OH)D缺乏。随着术后补充VD和肝功能的改善VD缺乏有所缓解，而25,(OH)D缺乏无明显改善，提示BA患儿可能存在VD活化障碍，而该机制可能参与BA肝纤维化的发生［7,14］。肝内VDR表达在肝纤维化过程中发挥的作用和机制需要进一步研究。抑制胆管上皮细胞内的VDR表达水平后，用VD3刺激胆管上皮细胞，胆管上皮细胞合成抗菌肽的能力下降，提示VDR在维持胆管上皮固有免疫中发挥重要作用［15］。Firrincieli等［12］研究发现VDR通过诱导抗菌防御而调控胆管上皮细胞的先天性免疫，进而维护胆管上皮的完整性。VDR的缺失是胆管型肝损伤的易感因素，VDR缺乏可破坏胆管上皮细胞的免疫功能及胆管上皮细胞间的连接能力。本研究发现IBDECs中VDR蛋白水平显著下降的BA患儿Kasai术后发生难治性胆管炎的频率更高，自体肝生存时间更短。Kasai术后难治性胆管炎的发生是BA不良预后的危险因素［8,16］。提示IBDECs中VDR表达降低可能是BA预后不良的标志。VDR在原发性胆汁性胆管炎（PBC）和原发性硬化性胆管炎（PBS）患者肝组织中表达水平均显著下调［17］。而本研究观察到肝纤维化程度严重的BA患儿及胆总管囊肿的患儿中，VDR蛋白在肝细胞中的表达水平显著升高。在非酒精性脂肪肝（NAFLD）患者及动物模型肝细胞中VDR的表达水平显著上调［18］。肝细胞中VDR的表达水平升高，是否是胆汁淤积引起肝细胞损伤的标志物还需要后续进一步研究证实。本研究结果和现有的研究报道提示VDR在肝内不同细胞中的表达趋势并不一致。胆汁淤积性肝细胞损伤时肝细胞内VDR的表达水平上升，而胆管上皮细胞中VDR表达水平出现显著下降。具体原因和机制还需要条件性敲除肝细胞或胆管上皮细胞中VDR的表达来进一步深入研究去揭示。胎儿及新生儿期呼肠孤病毒、轮状病毒和巨细胞病毒感染是国内外公认的BA潜在致病因素［2］。Poly(I∶C)是dsRNA的合成类似物，而dsRNA是一种与病毒感染相关的分子模式，因此Poly(I∶C)常被用于模拟细胞外dsRNA的作用［19］。本研究发现Poly(I∶C)可引起HiBECs凋亡增加、活力下降以及分泌多种炎症因子（IFN、TNF-α、IL-6），提示病毒感染可能会引起胆管上皮细胞损伤。同时本研究发现Poly(I∶C)还可引起 HiBECs 中VDR的表达水平显著下降。提示HiBECs中VDR表达下调，可能是Poly(I∶C)引起HiBECs损伤的标志物。本研究存在以下不足：本研究主要是通过临床标本观察到IBDECs中VDR表达水平显著下降的BA患儿Kasai术后难治性胆管炎发生率更高、肝纤维化程度更严重、自体肝生存时间也更短，提示IBDECs中VDR的表达水平可能是BA不良预后的标志物。在体外模拟病毒感染人肝内胆管上皮细胞系，也发现Poly(I∶C)可引起胆管上皮细胞损伤、凋亡增加的同时引起VDR的表达水平下降，提示VDR是病毒感染引起胆管上皮细胞损伤的标志。VDR激活剂在胆管结扎所致肝纤维化动物实验中显示出了潜在的治疗价值［20］。因此，胆管上皮细胞中VDR表达水平降低是BA发病及进展的“因”还是“果”需要进一步的深入研究。胆管上皮细胞VDR表达水平降低是否会引起肝纤维化？如何引起肝纤维化的分子机制也需要进一步深入研究。总之，IBDECs中VDR的表达水平可能是判断BA预后的潜在标志物，但仍需要扩大临床样本来证实。肝细胞中VDR的表达水平是否可以作为胆汁淤积性肝细胞损伤的标志仍需要通过不同胆汁淤积性肝病的病理进一步确认。VDR在胆管上皮细胞中表达水平降低是BA进展的“因”还是“果”值得进一步通过基础研究深入探讨。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
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