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作者：王行之 吴诚 李秋红 张娟 黄金莉 荆增辉 张盼盼 孙新通信作者：孙新，Email：sunxin6@fmmu.edu.cn作者单位：空军军医大学第一附属医院儿科，西安 710032本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(7):538-542.引用本文：王行之,吴诚,李秋红,等.混合益生菌通过程序性细胞死亡分子1及其配体1通路改善幼鼠食物过敏的机制研究[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(7):538-542.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20210927-01166.
摘要
目的 探讨混合益生菌对食物过敏的影响及其作用机制。方法 选取孕15 d的BALB/c小鼠采用随机数字表法分为对照组、食物过敏模型组和混合益生菌组。幼鼠出生后，首先食物过敏模型组和混合益生菌组采用卵清蛋白（OVA）致敏激发建立食物过敏模型；之后混合益生菌组于出生第21-35天给予益生菌溶液灌胃治疗；对照组采用9 g/L盐水灌胃。末次激发24 h后，制作肠道组织病理切片观察其病理变化，制备血涂片计数嗜酸性粒细胞，分离血清测定细胞因子及OVA特异性抗体，分离肠系膜淋巴结分析树突状细胞（DCs）和调节性T淋巴细胞（Tregs）。采用One-Way ANOVA或Kruskal-Wallis H检验进行3组间数据比较。结果 与食物过敏模型组相比，混合益生菌组小鼠腹泻评分显著降低［(2.00±0.71)分比(3.22±0.97分)］；嗜酸性粒细胞百分比、血清白细胞介素（IL）-4、IL-5、IL-13、肥大细胞蛋白酶1（MCPT-1）、OVA特异性抗体水平IgE和IgG水平均显著下降［（2.28±1.61）%比（10.99±2.26）%、（413.68±22.81） ng/L比（708.78±27.66） ng/L、（36.64±3.74） ng/L比（46.05±4.95） ng/L、（201.37±65.61） ng/L比（495.22±96.66） ng/L、（31 924.15±1 177.77） ng/L比（36 175.77±618.29） ng/L、（9.10±8.08） ng/L比（19.69±0.84） ng/L、（30.50±8.81） ng/L比（190.32±6.40） ng/L］；IL-10水平显著升高［（164.12±3.88） ng/L比（123.90±7.31） ng/L］，差异均有统计学意义（t=3.37、8.72、16.07、3.90、7.40、7.95、3.91、44.00、7.76，均 P<0.01）。与食物过敏模型组相比，混合益生菌组肠系膜淋巴结中CD103+DCs 及CD103+CD80-CD40-DCs表面的程序性细胞死亡分子配体1（PD-L1）水平显著升高［（75.59±0.45）%比（45.60±4.73）%、（67.56±1.87）%比（37.12±6.07）%］；Tregs在CD4+T淋巴细胞中的比例显著升高［（8.24±0.69）%比（6.20±0.66）%］；Tregs表面程序性细胞死亡分子1（PD-1）表达水平显著升高［（11.25±3.12）%比（4.08±2.33）%］，差异均有统计学意义（t=7.88、4.48、3.63、3.71，均 P<0.01）。结论 混合益生菌可改善幼鼠的食物过敏症状，降低炎症水平，其机制可能是通过PD-1/PD-L1通路调节Tregs的产生发挥作用。
关键词
食物过敏；益生菌；程序性细胞死亡分子1；程序性细胞死亡分子配体1；卵清蛋白；幼鼠
食物过敏（FA）是人体对于食物蛋白的异常免疫反应，可重复出现，导致肠道功能紊乱和损伤［1］。全球FA发病率约为10%，且呈逐年上升趋势［2］。儿童FA多始于2岁前并可能持续至成年，FA被认为是儿童过敏历程中的早期表现，会增加后期患变应性哮喘和鼻炎的风险［3］。因此FA早期干预和治疗十分重要，但目前对于FA的治疗尚无有效方法。研究表明，在生命最初几年，微生物组的发育和成熟受干扰可能对免疫系统产生有害影响，并导致变应性疾病的发展［4-5］。程序性细胞死亡分子1及其配体1（PD-1/PD-L1）相互作用的通路可产生抑制信号，控制T淋巴细胞的激活、耐受和免疫介导的组织损伤［6-7］。动物实验发现，PD-1/PD-L1通路在免疫耐受的早期形成和后期维持中起关键作用［8-9］。然而，PD-1/PD-L1通路在FA中的作用及肠道微生物是否可能通过该通路影响FA目前仍不清楚。因此，本研究通过建立幼年小鼠的FA模型模拟儿童FA，旨在探讨混合益生菌调节免疫耐受的作用及其是否与PD-1/PD-L1通路有关，以期为FA的防治提供新的思路和策略。
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资料与方法1.1 实验动物与分组 孕龄15 d的BALB/c小鼠，体质量55~59 g，购自空军军医大学动物实验中心。孕鼠采用随机数字表法分为对照组，食物过敏模型组和混合益生菌组，每组各2只。1.2 主要试剂和仪器 卵清蛋白（OVA，GradeV，美国Sigma公司）；氢氧化铝［Al（OH）3］粉末（天津天士力化学试剂公司）；混合益生菌菌粉（格氏乳杆菌，LK001，40%；唾液乳杆菌，LK002，20%；约氏乳杆菌，LK003，15%；副干酪乳杆菌，LK004，5%；罗伊氏乳杆菌，LK005，5%；动物双歧杆菌，LK011，15%，菌含量5×1010CFU/g）；流式细胞染色缓冲液（美国eBioscience公司）；流式抗体：异硫氰酸盐标记的CD4抗体（CD4-FITC）、藻红蛋白氰蓝染料标记的CD25抗体（CD25-PE Cy7）、别藻蓝蛋白标记的PD-1抗体（PD-1-APC）、藻红蛋白标记的叉状螺旋转录因子3（Foxp3）抗体（Foxp3-PE）、eflour450染料标记的Ikaros家族锌指蛋白2（Helios）抗体（Helios-eflour450）、异硫氰酸盐标记的CD103抗体（CD103-FITC）、藻红蛋白标记的CD11c抗体（CD11c-PE）、别藻蓝蛋白标记的CD40抗体（CD40-APC）、多藻叶绿素蛋白与eFluor 710染料标记的CD80抗体（CD80-PerCP-eFluor 710）、藻红蛋白氰蓝染料标记的PD-L1抗体（PDL1-PE Cy7）（美国eBioscience公司）。小鼠白细胞介素（IL）-4、IL-5、 IL-13 酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（美国Thermo Fisher公司）；anti-OVA IgE、anti-OVA IgG1 ELISA试剂盒（美国Chondrex公司）；肥大细胞蛋白酶1（MCPT-1）ELISA试剂盒（杭州联科生物）；超净工作台（苏州净化设备厂）；自动酶标检测仪（美国Bio Rad公司）；流式细胞仪BDFACSCalibur（美国BDBIOSciences）。1.3 方法1.3.1 孕鼠饲养 孕鼠置于动物房中适应性饲养至自然分娩，正常供给食水。孕鼠生仔后，对照组8只新生鼠，食物过敏模型组9只新生鼠，混合益生菌组9只新生鼠。小鼠均饲养于动物实验中心，恒定室温（21~25 ℃），湿度50%~65%，光照12 h/d，实验过程遵循动物保护和使用指南及“3R原则”，操作均严格遵守《实验动物管理与使用指南》［10］。1.3.2 FA模型制备 食物过敏模型组和混合益生菌组小鼠出生第0天、第7天和第14天采用含10 μg OVA和800 μg Al（OH）3 的9 g/L盐水配成20 μL致敏液进行腹腔注射致敏，并于第21-35天用OVA溶液（50 mg OVA∶200 μL 9 g/L盐水）进行灌胃激发，隔天１次。对照组采用等量9 g/L盐水进行腹腔注射和灌胃，其他条件不变。1.3.3 益生菌灌胃 子代鼠出生第21-35天，取混合益生菌菌粉配制成5×1010 CFU/L的菌液，每日200 μL菌液灌胃，对照组和食物过敏模型组予等量无菌9 g/L盐水灌胃。1.3.4 行为学及体质量评估 观察小鼠过敏情况（如腹泻、抓脸、擦鼻、打喷嚏、死亡），小鼠腹泻评分标准［11］：0级:无症状；1级:反复抓挠鼻部、耳朵；2级:活动减少、离群、眼睛和/或嘴周围水肿；3级:静止时间超过1 min，俯卧；4级:对刺激反应减弱或无反应；5级:震颤、抽搐或死亡。末次激发后每组小鼠称重。1.3.5 病理组织学分析 小鼠经末次OVA激发24 h后取结肠段组织，并浸泡在40 g/L多聚甲醛溶液中固定，经酒精脱水、石蜡包埋后切片，进行HE染色，在光学显微镜下观察肠道组织结构、炎症细胞浸润及肥大细胞数目的变化情况。1.3.6 嗜酸性粒细胞计数 小鼠取血后，立刻吸取10 μL全血进行涂片，待血膜固定后进行瑞氏吉姆萨染色，显微镜下计数嗜酸性粒细胞百分比。1.3.7 ELISA试验 根据ELISA试剂盒操作说明检测血清中IL-4、IL-5、IL-13、IL-10细胞因子和anti-OVA IgE、anti-OVA IgG1抗体及MCPT-1，并在450 nm处使用酶标仪测定吸光度（AD）值，测定结果转换为对应浓度。1.3.8 流式细胞分析 取小鼠肠系膜淋巴结进行研磨，用70 μm的滤网过滤，４ ℃ 1 000 r/min离心15 min（离心半径10 cm），收集细胞团，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗2遍并重悬成单细胞悬液，调整细胞浓度为（2~4）×1010/L。检测Tregs时，每管先加入100 μL调整好浓度的单细胞悬液，然后分别加入CD4、CD25及PD-1抗体于冰上避光孵育15~20 min，用流式细胞缓冲液清洗2次，4 ℃ 1 000 r/min离心5 min（离心半径10 cm），弃去上清，保留细胞沉淀。然后，在每管中加入1 mL固定破膜液后避光反应30~60 min，再加入2 mL破膜工作液后清洗2次，离心后弃去上清，保留细胞沉淀，1 000 r/min离心5 min（离心半径10 cm）。用100 μL破膜工作液重悬上述细胞沉淀，分别加入Foxp3-PE、Helios-eflour450抗体后室温避光孵育30 min。取适量流式液清洗上述细胞２次，室温1 000 r/min离心5 min（离心半径10 cm），留取细胞沉淀，用流式液重悬细胞至150 μL后上机检测。检测DCs时，每管先加入100 μL单细胞悬液，分别加入CD103、CD11c、CD40、CD80及PD-L1抗体于冰上避光孵育15~20 min，用流式细胞缓冲液清洗2次，4 ℃ 1 000 r/min离心5 min（离心半径10 cm），留取细胞沉淀，取流式液重悬细胞至150 μL后上机检测。1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。实验数据用x̄±s表示，若数据符合正态分布且具有方差齐性，采用One-Way ANOVA进行多组间比较，LSD法进一步进行组间两两比较；若数据不符合正态分布，采用Kruskal-Wallis H检验进行多组间比较，Mann-Whitney U检验进行两组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。
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结果2.1 幼鼠行为学观察及体质量监测 在激发过程中，食物过敏模型组小鼠出现明显腹泻、抓脸擦鼻、打喷嚏等过敏表现，对照组小鼠活动正常，无上述异常表现，混合益生菌组仅有轻微的打喷嚏、抓脸擦鼻症状，无死亡。腹泻症状评分结果显示，与对照组相比，食物过敏模型组症状评分升高［(3.22±0.97)分比(0.29±0.49)分］，差异有统计学意义（t=7.59，P<0.001）；混合益生菌组与食物过敏模型组相比，腹泻症状评分降低［(2.00±0.71)分比(3.22±0.97)分］，差异有统计学意义（t= 3.37，P<0.01）。体质量分析显示，食物过敏模型组与对照组、混合益生菌组相比［(20.19±2.39) g比(18.09±2.12) g比(21.07±2.28) g］，差异均无统计学意义（均P>0.05）。2.2 肠道组织病理染色 与对照组相比，食物过敏模型组炎症细胞浸润明显增加（蓝色箭头所示），肠道上皮脱落、糜烂（黑色箭头所示）；与食物过敏模型组相比，混合益生菌组小鼠肠道炎症反应相对较轻，炎症细胞浸润也明显较少，结构未见明显破坏（图1）。
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讨论本研究通过建立幼鼠FA模型模拟儿童FA，并予混合益生菌灌胃治疗，发现混合益生菌具有良好的调节免疫功耐受、抑制过敏反应的作用，且发现该作用与PD-1/PD-L1通路相关。研究发现，益生菌可调节肠道微生态，改善FA［12］，本研究发现，相比食物过敏模型组，混合益生菌组小鼠的过敏症状及腹泻症状评分、血清嗜酸性粒细胞比例、MCPT-1、辅助性T淋巴细胞2（Th2）型细胞因子（IL-4、IL-5、IL-13）及OVA特异性抗体水平均改善，差异均有统计学意义。研究发现PD-L1组成性表达在T淋巴细胞、B淋巴细胞、DCs、巨噬细胞等表面，并通过与PD-1相互作用，在免疫反应中起负性调节作用［8］。肠黏膜中的CD103+DCs及其表面的PD-L1是生发中心效应细胞耐受和调节的关键介质，可抑制反应性CD4+ T淋巴细胞的初始激活［13-15］。本研究分析CD103+DCs及其表面PD-L1表达水平发现，益生菌干预后，FA小鼠肠系膜淋巴结中CD103+DCs显著增加，同时这些DCs表面的PD-L1显著升高。有学者发现DCs可通过PD-L1促进Tregs分化，使用特异性抗体阻断PD-L1可减少Treg细胞的扩增［16-17］。Galea等［18］和Francisco等［19］研究发现PD-L1可通过多种途径将幼稚的CD4+T淋巴细胞转化为Tregs。以上结果提示，益生菌可能影响CD103+DCs 上PD-L1的表达水平。Tregs在维持肠道免疫中十分重要［2］。本研究结果显示，FA小鼠肠系膜淋巴结中的Tregs明显减少，混合益生菌组小鼠肠系膜淋巴结肿中的Tregs显著增加，且其表面PD-1水平也显著升高。研究发现，PD-L1/PD-1通路可调节T淋巴细胞的运动及DCs和靶细胞相互作用的时间［20］。这提示混合益生菌调节免疫耐受的作用机制很有可能是通过PD-L1诱导的Tregs发挥作用。本研究进一步分析DCs表面的共刺激分子CD40、CD80与PD-L1水平的关系，发现益生菌干预后CD103+CD80-CD40-DCs表达的PD-L1显著升高。Vanherwegen等［21］研究发现，DCs表达的共刺激分子（如CD80）与共抑制分子水平（如PD-L1）呈负相关。提示CD103+CD80-CD40-DCs亚群可能是在其中发挥免疫调节作用的主要DCs。因此推测，益生菌与肠黏膜的相互作用提高了CD103+DCs表面PD-L1水平，并通过PD-L1/PD-1通路发挥免疫调节作用，促进Tregs的分化，进而减轻Th2型免疫反应，降低IgE水平。在这个过程中，发挥重要调节作用的可能是CD103+CD80-CD40-DCs亚群。综上，混合益生菌可通过PD-L1/PD-1通路促进Tregs的产生，发挥免疫耐受调节作用，进而降低OVA诱导的炎症，改善幼鼠FA。本研究不仅有助于加深对FA机制的认识，且可为FA的诊疗及防治提供新思路和新方法。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
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