点击蓝字 关注我们
作者：熊冰瑶1,2 康志娟1,2 李志辉1,2 通信作者：李志辉，Email：Lizh0731@aliyun.com作者单位：1南华大学儿科学院，长沙 410007；2湖南省儿童医院肾脏风湿科，长沙 410007本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(8):626-630.引用本文：熊冰瑶,康志娟,李志辉.脂肪量和肥胖相关蛋白在人肾小管上皮细胞缺血再灌注损伤中的作用[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(8):626-630.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20210116-00070.
摘要
目的 探讨脂肪量和肥胖相关蛋白（FTO）在人近端肾小管上皮细胞（HK-2）缺血再灌注损伤（IRI）中的作用。方法 以HK-2细胞作为研究对象，用抗霉素A、A23187、2-脱氧葡萄糖构建HK-2细胞IRI模型。将细胞分为对照组及缺血再灌注组（I/R组）。实时荧光PCR（qPCR）法及Western blot法分别检测2组细胞FTO、B细胞淋巴瘤/白血病2相关X基因（Bax）、B细胞淋巴瘤/白血病基因2（Bcl-2）、剪切型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cleaved Caspase-3）的mRNA及蛋白表达水平。流式细胞术检测细胞凋亡。比色法检测mRNA N6-甲基腺苷（m6A）甲基化水平。结果 1.与对照组比较，I/R组细胞FTO mRNA（0.15±0.05比1.00±0.23） 、Bcl-2 mRNA（0.14±0.07比1.02±0.25）相对表达量降低，Bax（3.10±0.35比1.00±0.13）、cleaved Caspase-3 mRNA（4.21±0.56比1.00±0.09）相对表达量增高，差异均有统计学意义(t=6.28、5.84、-9.83、 -9.84， 均P<0.01)。2.与对照组比较，I/R组FTO蛋白（0.69±0.14比1.37±0.02）、Bcl-2蛋白（0.50± 0.12比1.25±0.21）降低，Bax蛋白（1.04±0.08比0.57±0.06）、cleaved Caspase-3蛋白（0.99±0.05比0.36±0.07） 相关表达量增高，差异均有统计学意义(t=8.10、5.49、-8.22、-12.09，均P<0.05)。3.与对照组比较，I/R组HK-2细胞凋亡率［(61.70±1.01)%比(0.16±0.10)%］增高，差异有统计学意义( t=63.80,P<0.01)。4.与对照组比较，I/R组总mRNA m6A水平在总RNA中的百分比［(3.13±0.21)% 比(1.10±0.26)%］增高，差异有统计学意义( t=-10.61,P<0.01)。结论 FTO介导的RNA m6A修饰可能通过调控HK-2细胞凋亡影响肾脏IRI。
关键词
缺血再灌注损伤；肾小管上皮细胞；脂肪量和肥胖相关蛋白；细胞凋亡；N6-甲基腺苷
缺血再灌注损伤（IRI）是指组织在缺血基础上恢复血供后，损伤反而加重的现象。肾脏IRI是临床上导致急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）的常见原因，其发病率逐年上升，病死率高达40%~50% ［1-2］ 。肾脏IRI机制可能与缺血再灌注后的炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等有关［3-8］ 。IRI后细胞内氧自由基堆积、钙离子超载、炎症反应等均可触发细胞凋亡。作为代谢最旺盛的肾脏细胞，人肾小管上皮细胞（HK-2）的凋亡最为显著，在IRI导致的AKI中发挥了重要作用［9-10］ 。N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)是指在RNA腺嘌呤第6位C原子相连的氨基上发生的甲基化修饰［11］ 。作为一种在肥胖或代谢性疾病中备受关注的蛋白质，脂肪量和肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated protein，FTO）2011年才被发现在RNA m6A甲基化过程中发挥了重要的去甲基化作用［12］ 。研究发现，FTO可通过降低mRNA m6A修饰水平，促进细胞增殖，减少细胞凋亡［13］ 。目前尚未见FTO在肾脏IRI中的研究。本研究通过构建HK-2细胞IRI模型，检测IRI前后HK-2细胞中FTO水平变化、凋亡情况及细胞整体m6A水平变化，旨在揭示FTO在肾脏IRI中的作用机制，为AKI的防治提供新的思路。
1
资料与方法1.1 细胞和试剂 采用HK-2细胞作为研究对象（由中南大学湘雅三医院实验室惠赠)。实时荧光定量PCR（qPCR）试剂盒（南京诺唯赞公司）；m6A RNA甲基化定量试剂盒（美国Epigentek公司）；总RNA极速提取试剂盒（上海飞捷公司）；反转录试剂盒（美国Fermentas公司）；兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体、剪切型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cleaved Caspase-3）抗体、B细胞淋巴瘤/白血病2相关X基因（Bax）抗体（美国CST公司）、兔抗人B细胞淋巴瘤/白血病基因2（Bcl-2）、FTO抗体(英国Abcam公司)，膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）/7-氨基-放线菌素D（7-AAD）细胞凋亡试剂盒(美国BD公司)。1.2 细胞培养、分组及模型建立 本实验分为对照组、缺血再灌注（I/R）组。将HK-2细胞复苏后进行贴壁细胞常规培养。待细胞长至对数生长期后，接种至6孔细胞培养板上常规培养24 h。细胞生长至约80％融合时，对实验组细胞进行药物处理，建立HK-2细胞IRI模型。具体方法如下：将实验组细胞用磷酸盐缓冲溶液（PBS）清洗2遍，然后加入无血清的DMEM/F12培养基，再加入抗霉素A、2-脱氧葡萄糖及A23187溶液，使其终浓度分别为10 μmol/L、10 mmol/L及1 μmol/L，继续放入细胞培养箱中培养1 h，弃培养液，用37℃预热的PBS液漂洗2遍，换为含胎牛血清的完全培养基继续培养12 h［14］ ，分别收集2组细胞进行下一步实验，每次实验每组样本3个，重复3次实验。1.3 qPCR法检测FTO、Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3 mRNA表达水平 按照总RNA极速提取试剂盒说明，分别提取对照组、I/R组细胞的总RNA后，根据反转录试剂盒说明书将RNA反转录成单链cDNA，再以cDNA为模板，参照qPCR试剂盒说明书进行PCR扩增。反应体系如下：SYBR预混液10.0 μL，上游引物 0.4 μL，下游引物 0.4 μL，cDNA 模板 2.0 μL，双蒸水（ddH2O） 7.2 μL。扩增条件如下：95℃ 30 s预变性；95℃ 10 s，60℃ 30 s，共40个循环；95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s采集熔解曲线。最后以GAPDH为内参，采用2-△△ct 法分别计算2组细胞中FTO、Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3 mRNA的相对表达水平。qPCR引物序列见表1。
2
结果2.1 HK-2细胞IRI后细胞形态变化 正常HK-2细胞呈长梭形改变，贴壁后可见触角伸出。予以IRI后可见贴壁细胞明显减少，少量贴壁的细胞触角回缩、细胞膜皱缩，细胞形态多变，呈现圆形、三角形、椭圆形等。细胞间隙增宽，培基中可见大量漂浮的细胞碎片。2.2 FTO、Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3 mRNA表达水平变化 与对照组比较，I/R组细胞FTO、Bcl-2 mRNA相对表达量降低、Bax、cleaved Caspase-3 mRNA相对表达量增高，差异均有统计学意义(均P<0.01)，见表2。
3
讨论HK-2细胞是肾脏多种细胞中对凋亡最敏感的细胞，其凋亡是AKI的经典标志。细胞凋亡主要包括线粒体途径、死亡受体途径及内质网途径。其中线粒体途径是最主要的凋亡信号传导途径，也是介导HK-2细胞凋亡的主要途径。Bcl-2蛋白家族和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteine aspartic acid specific protease,Caspase) 家族在线粒体凋亡途径中发挥了重要作用。在Bcl-2蛋白家族中，Bax具有促进细胞凋亡的作用，Bcl-2则与之相反，两者在细胞内的比值决定了细胞是走向凋亡还是生存。体内和体外实验均发现，Bax和Bcl-2参与IRI后HK-2细胞凋亡［15］ 。一般情况下，Bcl-2家族蛋白以无活性状态聚集在肾细胞线粒体膜外壁，直到被肾毒性药物、缺血损伤等外在条件刺激，导致其激活或失活，进而增加线粒体膜孔通透性，使其释放凋亡因子细胞色素C，活化下游Caspase家族蛋白，直接参与细胞凋亡。研究发现，肾脏缺血损伤诱导凋亡相关蛋白活化，利用基因技术或药物选择性地增加Bcl-2的表达可显著减少IRI后的HK-2细胞凋亡，改善器官功能 ［16-17］ 。本研究发现，在肾脏I/R后，HK-2细胞凋亡增加，Bax、cleaved Caspase-3 mRNA及蛋白表达量上升，Bcl-2 mRNA及蛋白表达量下降，提示线粒体凋亡途径在IRI导致的HK-2细胞凋亡中发挥了重要作用，与以往研究相符。m6A甲基化作为真核生物中最丰富的一种甲基化修饰方式，近年来受到了广泛的关注。它可以通过调节mRNA剪接、输出、定位、翻译和稳定性等mRNA代谢过程的各个方面［18］ 。m6A失衡与许多缺氧性疾病的发生发展有着密切的关系。在对脑、心脏及肾脏这些容易受到IRI的器官研究中均发现，缺氧可诱导相应的组织和细胞m6A水平增高［19-22］ 。本研究发现肾脏IRI后，HK-2细胞整体m6A RNA修饰水平增加，与以上研究一致。m6A RNA修饰水平受到甲基化转移酶、去甲基化酶的共同调控。在关于缺氧性疾病的研究中，去甲基化酶FTO受到了广泛的关注。研究发现去甲基化酶FTO在衰竭的小鼠心脏组织和缺氧心肌细胞中表达降低，过表达FTO可有效改善心脏功能，减轻心脏重构［23］ ，而FTO的心脏保护机制主要通过选择性地使与缺血心脏收缩相关的转录本去甲基化，增加mRNA的稳定性和蛋白的表达来实现［19］ 。在大鼠大脑中动脉闭塞后的大脑皮质组织和缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）后原代神经元中，m6A RNA修饰水平均明显升高，FTO表达下降，过表达FTO对I/R处理的神经元起保护作用［21］ 。说明缺氧刺激可能导致FTO表达下降，进而增加m6A RNA修饰水平，调控细胞凋亡。本研究中，HK-2细胞I/R后，FTO mRNA与蛋白水平下降，与上述研究一致。然而，在缺氧刺激下，不仅去甲基化酶FTO表达降低，其余甲基化相关酶的水平也发生了变化。研究显示，甲基转移酶样3（METTL3）在心肌梗死患者的心脏组织中表达量较正常患者显著上调；在体外实验中，上调METTL3可增加H/R处理的心肌细胞的m6A水平，促进其凋亡，敲减METTL3则可增强H/R处理的心肌细胞活力［24］ 。此外，过表达去甲基化酶α-酮戊二酸依赖性双加氧酶同系物5（α-ketoglutarate-dependent dioxygenase alkB homolog 5,ALKBH5）可逆转METTL3对H/R处理的心肌细胞损伤 ［24］ 。在AKI患者肾脏组织中，甲基转移酶样14（METTL14）表达量与非AKI患者相比显著增加，且METTL14的表达水平与血清肌酐水平呈正相关，进一步构建肾脏IRI小鼠和IRI-HK-2细胞模型后发现，敲除METTL14基因可在体内外减轻肾脏/HK-2细胞IRI损伤［20］ 。提示多种甲基化相关酶参与缺氧性疾病的病理过程。此外，甲基化相关酶之间的相互作用也值得关注。有研究发现心肌梗死后1周，全基因组m6A水平才显著增高，但FTO水平早在心肌梗死后4 h就已经开始下调，那么，是什么导致此时m6A水平无明显变化？原来去甲基化酶ALKBH5在心肌梗死后4 h~1 d表达上调，在这段时间，ALKBH5的增加可抵消FTO降低导致的m6A RNA水平增加，而只有当梗死后1周左右ALKBH5蛋白表达恢复至正常时，此时m6A水平才显著增高，这主要是因为FTO水平的降低引起的［23］ 。ALKBH5这种看似矛盾的变化趋势在脑IRI的研究中也得到了证实［22］ 。研究发现，大鼠大脑中动脉闭塞后的大脑皮层组织和H/R后原代神经元中m6A RNA修饰水平明显升高，ALKBH5表达上升、FTO表达下降；进一步的研究发现，抑制神经元中的ALKBH5表达导致I/R处理后的神经元凋亡，过表达神经元中的FTO则导致I/R处理后的神经元凋亡减少。这种现象的存在可能与H/R处理后的神经元中FTO水平降低，导致m6A水平增加，Bcl-2甲基化水平增加，增加了Bcl-2转录本的降解，导致Bcl-2蛋白表达降低；而同时m6A水平增加导致了去甲基化酶ALKBH5代偿性增高，ALKBH5可以清除Bcl-2 mRNA上的m6A修饰，提高了Bcl-2 mRNA的稳定及Bcl-2蛋白的表达，在一定程度上起到了限制H/R后神经元凋亡的作用 ［22］ 。这也可以解释心肌梗死后梗死灶周围ALKBH5表达增加，与细胞整体m6A水平增加相矛盾，但过表达ALKBH5又可以减轻心肌缺血再灌注损伤。说明ALKBH5虽与FTO表达变化趋势不同，但可能同样在缺氧性疾病的发展中起保护作用，可限制疾病进展。以上研究提示，在疾病的演变过程中，甲基化相关酶的相互作用至关重要。综上所述，HK-2 IRI后细胞凋亡增加，去甲基化酶FTO表达下降，m6A水平增高。FTO可能通过调节细胞m6A RNA修饰水平进而调控细胞凋亡。但本研究存在不足之处，仅检测了去甲基化酶FTO的变化水平。其余去甲基化酶和甲基化转移酶的变化也可以引起m6A水平增高，甲基化酶、去甲基化酶和阅读蛋白之间的相互作用也可能对HK-2细胞IRI中蛋白表达的调控很重要，这些需要进一步的实验进行明确。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
点击“阅读原文”免费下载PDF全文