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作者：何孝亮 陈雨青 林宏华 高健 邓茜 王娟娟 陈登环 王忻 蔡文娟 韩艳平 高雨彤通信作者：陈雨青，Email:894839405@qq.com作者单位：安徽省儿童医院风湿免疫科，合肥 230001本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(13):988-991.引用本文：何孝亮,陈雨青,林宏华,等.miR-146a在全身型幼年特发性关节炎患儿外周血单个核细胞中的表达及其临床意义[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(13):988-991.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20210726-00881.
摘要
目的 探讨miR-146a在全身型幼年特发性关节炎（sJIA）发病机制中的作用及其临床意义。方法 前瞻性临床队列研究。选择2018年6月至2020年12月安徽省儿童医院风湿免疫科收治的sJIA患儿26例（初发活动组14例，稳定组12例）、多关节型幼年特发性关节炎（JIA）患儿15例、少关节型JIA患儿15例。门诊健康体检儿童20例为健康对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测研究对象外周血单个核细胞（PBMCs）中miR-146a表达水平，采用酶联免疫吸附试验检测sJIA患儿、健康对照组儿童血清中白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-1β水平。采用方差分析比较不同组间PBMCs中miR-146a表达水平及细胞因子水平的差异；采用Pearson相关分析对sJIA患儿PBMCs中miR-146a相对表达水平与临床炎症指标及血清中细胞因子进行相关性分析。结果 1.miR-146a在初发sJIA患儿PBMCs中相对表达水平显著高于多关节型JIA组、少关节型JIA组(8.77±3.15比4.40±1.59、2.55±1.15，t=6.27、14.23,均P<0.05)；sJIA活动组显著高于sJIA稳定组(8.77±3.15比3.63±1.37，t=10.27,P<0.05)，差异均有统计学意义；sJIA稳定组与健康对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。2.sJIA活动组血清中IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平显著高于sJIA稳定组［（58.56±17.47） ng/L比（26.32±10.54） ng/L，（73.72±11.16） ng/L比（23.20±9.12） ng/L，（70.93±19.97） ng/L比（24.25±9.49） ng/L］，差异均有统计学意义（均P<0.05）；sJIA稳定组与健康对照组比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）。3.sJIA患儿PBMCs中miR-146a表达与血清铁蛋白、血小板、红细胞沉降率、C反应蛋白以及血清中IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平均呈正相关（r=0.542、0.433、0.329、0.306、0.333、0.342、0.319，均P<0.05）。结论 miR-146a可能参与sJIA疾病炎症活动过程；miR-146a能较好区分sJIA与多关节型JIA、少关节型JIA；TNF-α、IL-1β、IL-6参与sJIA炎症反应。
关键词
幼年特发性关节炎；全身型；microRNA-146a
全身型幼年特发性关节炎（systemic juvenile idiopathic arthritis，sJIA）除关节炎表现外，主要以发热、淋巴结大、皮疹、多浆膜腔积液等全身临床表现为主，严重者可并发巨噬细胞活化综合征危及患儿生命［1］。其发病机制至今尚未完全清楚。与自身免疫性疾病相比，sJIA无明确自身抗体，近年来研究发现，sJIA属于自身炎症性疾病范畴［2-3］，固有免疫异常在sJIA发病机制中起重要作用，单核巨核细胞被活化后，分泌大量致炎蛋白前体，进而激活Toll样受体4（Toll like receptor 4，TLR4）与核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)信号通路，产生大量白细胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6、IL-18等促炎因子，从而导致sJIA患者体内高炎症反应状态［4-6］。微小RNA（miRNAs）为一类含20~25个核苷酸的非编码RNA，其通过与基因3′端非翻译区结合靶向抑制基因表达。研究发现，miR-146a可抑制过度炎症反应，在免疫调节中起负反馈调节作用［7-12］。miR-146a可靶向抑制TLR4/NF-κB通路中的白细胞介素受体相关激酶1(interleukin-receptor-associated kinase，IRAK1)及肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)等表达，降低 NF-κB 通路活性，实现阻止过度炎症损伤［10，12-13］。推测miR-146a 可能参与sJIA炎症反应过程。本研究检测sJIA、多关节型幼年特发性关节炎（JIA）及少关节型JIA患儿外周血单个核细胞（PBMCs）中miR-146a的表达水平，结合临床炎症指标进行分析，探讨miR-146a 在sJIA发病中的作用。
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资料与方法1.1 研究对象 前瞻性临床队列研究。选择2018年6月至2020年12月安徽省儿童医院风湿免疫科收治的sJIA患儿26例、多关节型JIA 15例、少关节型JIA 15例。按照2001年国际风湿病联盟提出JIA诊断分类标准［14］。26例sJIA患儿中，14例确诊初发未治疗且病情活动患儿（sJIA活动组），12例为门诊随访病情稳定者（sJIA稳定组）；男11例，女15例；年龄(10.84±7.47)岁。15例多关节型JIA及15例少关节型JIA均为确诊且未治疗初发患儿。健康对照组为儿科健康体检20例，其中男11例，女9例；年龄（9.32±1.45）岁。sJIA组与健康对照组之间性别、年龄差异均无统计学意义（均P>0.05）。本研究通过医院医学伦理委员会批准（批准文号：EYLL-2018-020），患儿监护人均同意并签署知情同意书。1.2 方法1.2.1 主要仪器 实时定量聚合酶链反应（qPCR）仪ABI 7500型（美国ABI公司），PCR扩增仪（美国Beckman-Coulter公司），低温离心机（美国Beckman-Coulter公司），-20 ℃低温冰箱（合肥海尔公司），-80 ℃低温冰箱（日本SANYO公司）。1.2.2 主要试剂 miR-146a反转录试剂盒（广州复能基因有限公司），miR-146a的PCR引物（广州复能基因有限公司），IL-1β、IL-6、TNF-α检测试剂盒（美国A&D公司）。1.2.3 PBMCs、血清提取 取研究对象外周静脉血10 mL，5 mL抗凝用于提取PBMCs，TRIzol溶解后，用于提取RNA。5 mL非抗凝血离心10 min（1 500 r/min，离心半径10 cm）提取血清，用于检测细胞因子。1.2.4 细胞因子检测 采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测sJIA患儿与健康对照组血清中IL-6、TNF-α、IL-1β水平。1.2.5 miR-146a反转录 PolyA Polymerase（2.5 U/L）1 μL、模版RNA（终浓度0.8 μg）、Rtase Mix 1 μL、5×Reaction Buffer 5 μL，加焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）处理水至25 μL，置水浴箱中37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min灭活，加入DEPC水稀释，置-80 ℃冰箱保存。1.2.6 PCR反应 miR-146a qPCR反应液：miR-146a和内参U6引物（2.0 μmol）2.0 μL、2×多合一 qPCR 混合物 10.0 μL、通用适配器 PCR 引物（2.0 μmol）2.0 μL、荧光定量PCR参比燃料（50×）0.4 μL 、第1链 cDNA 2.0 μL、ddH2O 3.6 μL，混匀后进行qPCR反应，反应条件为 95 ℃ 10 min预变性→（95 ℃ 15 s 变性→60 ℃ 30 s退火→72 ℃ 10 s）×40个循环。作融解曲线。结果以反应管内的荧光信号到达设定的阈值时循环数Ct表示，miR-146a相对表达水平用2-△△Ct值表示。1.3 统计学处理 采用SPSS 23.0软件进行统计分析。符合正态分布计量资料用x̄±s表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，变量间相关分析采用Pearson相关分析。受试者工作特征曲线（ROC）评估miR-146a对sJIA的诊断价值。P<0.05为差异有统计学意义。
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结果2.1 一般资料 26例sJIA患儿中，活动组14例，稳定组12例，活动组血清铁蛋白（SF）（582.5±292.63） μg/L、血小板计数（PLT）为（397.14±145.39）×109/L、红细胞沉降率（ESR）为（46.86±19.34） mm/1 h、C反应蛋白（CRP）为（52.57±22.38） mg/L。2.2 miR-146a在sJIA活动组、sJIA稳定组及健康对照组的表达 sJIA活动组中PBMCs中miR-146a表达显著高于sJIA稳定组（8.77±3.15比3.63±1.37），差异有统计学意义(t=10.27，P<0.05)；sJIA稳定组与健康对照组（1.90±1.02）比较，差异无统计学意义(P>0.05)。2.3 miR-146a在初发sJIA组、多关节型JIA组及少关节型JIA组的表达 miR-146a在初发sJIA组中表达显著高于多关节型JIA组和少关节型JIA组（8.77±3.15比4.40±1.59、2.55±1.15），差异均有统计学意义(t=6.27、14.23，均P<0.05)，多关节型JIA组与少关节型JIA组比较差异无统计学意义(P>0.05)。2.4 miR-146a对sJIA的诊断价值 区分sJIA与JIA（包括多关节型、少关节型）时，ROC曲线下面积（AUC）为0.946（95%CI:0.892~1.000），当截断值为5.330时，敏感性和特异性分别为81.5%和89.7%。结果见图1。
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讨论研究表明，miR-146a不仅参与炎症反应、细胞形成与凋亡、肿瘤形成等病理生理过程［11-12，15-18］，还参与类风湿性关节炎、干燥综合征、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的发病，且与疾病活动性相关［19-22］。miR-146a在固有免疫中也起重要作用，可调节巨核细胞分化［23-25］，防止过度免疫炎症损伤。Li等［26］研究发现，miR-146a通过靶向抑制素βA亚基基因（inhibin βA subunit gene，INHBA）调节巨核细胞向分化，抑制炎症反应，参与sJIA炎症反应过程。本研究结果显示，sJIA活动组患儿PBMCs 中miR-146a表达水平显著高于sJIA稳定组，与临床相关炎症指标SF、PLT、ESR、CRP呈正相关。sJIA活动组血清中IL-6、TNF-α、IL-1β等炎症因子明显高于sJIA稳定组、健康对照组，且miR-146a表达水平与上述炎症细胞因子呈正相关，推测miR-146a可能在sJIA疾炎症反应过程中起重要作用。miR-146a在 sJIA活动组患儿PBMCs中表达水平增加，可能原因为活动期患儿体内单核巨核细胞被活化，产生大量IL-1、IL-6、IL-18等促炎因子，进而促使 miR-146a基因表达增加，过表达miR-146a靶向抑制TLR4/NF-κB信号衔接分子IRAK1、TRAF6，降低NF-κB信号通路活性，减少促炎因子产生，阻止过度炎症反应［12-13］。也有研究发现，miR-146a在sJIA单核巨噬细胞中表达增加，进一步研究显示其靶向INHBA表达抑制M1巨噬细胞活化，促进M2巨噬细胞活化，进而起抗炎作用［26］。综上，miR-146a在sJIA活动组患儿PBMCs中表达增加，与临床炎症指标及血清中IL-6、TNF-α、IL-1β炎症细胞因子呈正相关，可能参与sJIA体内高炎症反应，具体作用机制有待进一步研究。目前sJIA临床诊断尚无特异性实验室指标。本研究结果显示，初发sJIA患儿PBMCs中miR-146a表达水平显著高于初发多关节型JIA组、少关节型JIA组，多关节型JIA组与少关节型JIA组无显著性差异，可能原因为sJIA患儿体内固有免疫异常，导致大量单核细胞/巨噬细胞活化，产生大量促炎因子，诱导了miR-146a基因表达增加［13］，过表达miR-146a可负反馈抑制具有促炎作用的M1巨噬细胞活化，减少促炎细胞因子产生［26］。同时本研究为评估PMBCs中miR-146a能否作为sJIA潜在新型标志物，进行了ROC曲线分析，结果显示miR-146a能较好地将sJIA患儿与JIA（包括多关节型、少关节型）患儿区分开来，敏感性和特异性均在80%以上。这提示，PBMCs中miR-146a可能是一种区分sJIA和JIA（包括多关节型、少关节型）的新型标志物。sJIA属于自身炎症性疾病，细胞因子网络调节异常为重要特征。本研究结果也显示，sJIA活动组患儿血清中IL-6、TNF-α、IL-1β表达水平明显高于sJIA稳定组和健康对照组，sJIA稳定组与健康对照组无显著差异，提示sJIA患儿血清中IL-6、TNF-α、IL-1β表达水平与病情活动性有关，参与sJIA患儿体内炎症反应过程。综上，sJIA患儿PBMCs中miR-146a表达上调，且与sJIA临床炎症指标及炎症细胞因子呈正相关，miR-146a可能参与sJIA患儿体内炎症反应过程。miR-146a 能较好地将sJIA患儿与JIA（包括多关节型、少关节型）患儿区分开来，可作为sJIA诊断的一个辅助指标。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
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