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作者：王叨 王玮琳 丁艳杰 汤苗苗 陈娇 游红亮 张蕾通信作者：王叨，Email:deai315@163.com 作者单位：郑州大学第一附属医院儿科，郑州 450052本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(13):992-996.引用本文：王叨,王玮琳,丁艳杰,等.人再生胰岛衍生蛋白、可溶性抑瘤因子2、肿瘤坏死因子受体1在儿童异基因造血干细胞移植术后肠道急性移植物抗宿主病诊疗中的价值[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(13):992-996.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20210810-00952.
摘要
目的 探讨外周血中人再生胰岛衍生蛋白（REG3α）、可溶性抑瘤因子2（sST2）、肿瘤坏死因子受体1(TNFR1) 3种生物蛋白标志物表达水平对儿童异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）术后肠道急性移植物抗宿主病（aGVHD）诊断和疗效评估的临床应用价值。方法 回顾性分析2020年1月至2021年2月在郑州大学第一附属医院儿科接受allo-HSCT患儿50例的临床资料，男39例，女11例；中位年龄8.5（1~13）岁。在移植前，移植后1周、2周、3周、5周、7周、9周、11周、13周，出现肠道aGVHD时，治疗后检测上述3种生物蛋白表达水平，将发生肠道aGVHD患儿作为观察组，无肠道aGVHD患儿作为对照组，分析2组患儿外周血中3种生物蛋白表达水平的差异是否有统计学意义。采用受试者工作特征曲线（ROC）评价上述3种生物蛋白对肠道aGVHD的诊断价值，采用独立样本t检验比较肠道aGVHD患儿治疗前后3种生物蛋白表达差异。结果 1.观察组外周血中的REG3α、sST2、TNFR1水平分别为（33 985.42±24 631.33） ng/L、（139 899.66±115 825.65） ng/L、（3 041.65±2 418.72） ng/L，均高于对照组［（7 457.39±4 547.49） ng/L、（32 059.57±23 452.85） ng/L、（1 944.51±1 170.35） ng/L］，差异均有统计学意义（t=6.04、5.19、2.17，均P<0.05）。2.REG3α联合sST2诊断肠道aGVHD的ROC曲线下面积（AUC）为0.952（95％CI: 0.851~0.992，P<0.001），Youden指数最大值为0.894，对应灵敏度为83%，特异度为99%；其诊断价值优于REG3α、sST2、TNFR1单个指标（Z=1.763、1.332、3.001，均 P<0.05）；3.肠道aGVHD患儿治疗有效组治疗前外周血中REG3α、sST2、TNFR1水平分别为（31 343.01±25 364.71） ng/L、（146 629.52±110 501.04） ng/L、（2 489.00±859.70） ng/L，治疗后下降［（12 104.37±11 704.60） ng/L、（93 539.55±81 920.93） ng/L、（2 048.15±813.47） ng/L］，REG3α、sST2表达水平显著降低，差异均有统计学意义（t= -3.23、-2.10，均 P<0.05），TNFR1表达水平变化差异无统计学意义（P>0.05）。结论 REG3α、sST2可作为临床辅助诊断肠道aGVHD的重要参考指标，具有较好的辅助诊断价值，也可作为评价临床治疗肠道aGVHD疗效的客观指标。
关键词
异基因造血干细胞移植；儿童；生物蛋白；肠道；急性移植物抗宿主病
急性移植物抗宿主病（acute graft versus host disease，aGVHD）是异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）术后的主要并发症和死亡原因之一［1］，尤其是肠道aGVHD的发病率高达50%～60%［2］，致死率15%～40%［3］，一旦发生，严重威胁患儿生命。因此，如何早期识别、早期诊断肠道aGVHD是血液移植医师面临的一项重要课题。目前对肠道aGVHD诊断方法主要是基于临床症状和创伤性黏膜活检，缺乏早期预测、辅助诊断的客观指标。国内外鲜见有关生物蛋白标志物在儿童肠道aGVHD的预测、诊断方面的相关研究报道。本研究通过动态监测移植患儿外周血中人再生胰岛衍生蛋白（regenerating islet-derived protein 3-alpha，REG3α）、可溶性抑瘤因子2（soluble tumor suppressor factor 2，sST2）、肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1)3种生物蛋白表达水平变化，探讨这3种生物蛋白对儿童allo-HSCT术后肠道aGVHD的诊断、疗效评估的临床应用价值，为其临床应用提供试验依据。
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资料与方法1.1 研究对象 回顾性分析。选取2020年1月至2021年2月在郑州大学第一附属医院儿科行allo-HSCT的50例患儿为研究对象，男39例，女11例，中位年龄8.5（1~13）岁。纳入标准：(1) 年龄不超过14岁；(2) 首次行allo-HSCT术；(3) 移植前未合并严重胃肠道疾病，重要器官功能尚可；（4） 移植后合并单一肠道aGVHD或以肠道aGVHD为主（可同时合并皮肤、肝脏 Ⅰ～Ⅱ 级aGVHD，但经治疗后3～7 d很快好转）；（5）有完整临床资料及随访资料。排除标准：（1）肠道aGVHD合并其他器官出现Ⅲ～Ⅳ级aGVHD患儿；（2）有严重消化道基础疾病患儿；（3）依从性不佳，未按规定时间点采集样本或中途退出采样；(4) 不能定期随访；(5) 静脉采血困难者（如有晕针、晕血史）。本研究通过医院医学研究伦理委员会批准（批准文号：KY-2020-0248），标本采集前均获得患儿监护人知情同意并签署知情同意书。1.2 研究方法 1.2.1 试验分组 肠道aGVHD分级采用改良的aGVHD Glucksberg 分级标准［4］。将发生肠道aGVHD 患儿作为观察组，无肠道aGVHD 患儿作为对照组。动态监测患儿移植前及移植后1周、2周、3周、5周、7周、9周、11周、13周、出现肠道aGVHD时、治疗4周后REG3α、sST2、TNFR1 3种生物蛋白表达水平，分析比较2组患儿外周血中3种生物蛋白水平差异。根据肠道aGVHD 患儿抗排异治疗后疗效，分为治疗有效组和治疗无效组，比较治疗前及治疗4周后患儿外周血中REG3α、sST2 、TNFR1 3种生物蛋白表达变化。1.2.2 肠道aGVHD的防治策略 同胞相合移植预防方案：环孢素（CsA）联合短程吗替麦考酚酯（MMF），CsA 1.5 mg/kg，-1 d开始，每12 h 1次，静脉输注，MMF 30 mg/（kg·d），+1 d开始给药，分2～3次口服。单倍体和非血缘供者移植预防方案：CsA+短程甲氨蝶呤(MTX)+MMF+抗胸腺细胞球蛋白（ATG）：CsA和MMF用法同上，MTX +1 d按15 mg/m2，+3 d、+6 d按10 mg/ m2，静脉推注，ATG 2.5 mg/（kg·d），-5~-2 d静脉输注。脐血移植预防方案：CsA 联合 MMF，用法同上。当患儿并发肠道aGVHD时，在一线治疗药物CsA或他克莫司治疗基础上，联合糖皮质激素，治疗5~7 d后评估疗效，如考虑糖皮质激素耐药，加用二线药物（如巴利昔单抗、芦可替尼、英夫利西单抗、西罗莫司等）［5］。1.2.3 疗效评估 依据中国allo-HSCT治疗血液系统疾病专家共识［6］，观察患儿每日腹泻量及腹泻次数进行评估。完全缓解（CR）定义为患儿肠道aGVHD表现完全消失；部分缓解（PR）定义为治疗后腹泻次数及腹泻量较前减少（至少降低1个级别）但未达到CR，无其他靶器官aGVHD恶化；无反应（NR）定义为患儿每日腹泻量及腹泻次数无改善也没有恶化或患者死亡；进展（PD）指患儿每日腹泻量及腹泻次数较前增多（至少增加1个级别），伴或不伴其他器官aGVHD的改善。PD和NR为治疗无效。1.2.4 Luminex平台检测REG3α、sST2、TNFR1表达水平 多功能流式点阵仪（luminex 200型）购买于美国Luminex公司，Human Magnetic Luminex Premixed Multiplex Kit试剂盒购买于美国R&D Systems公司。收集研究对象外周血2 mL 至无抗凝剂（红帽）采血管中，参照说明书操作，90 min内上机检测。1.3 统计学处理 采用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以x̄±s表示，组间比较采用成组资料t检验，分类变量组间比较采用χ2检验或Fisher′s精确检验。采用受试者工作特征（ROC）曲线评估每种生物标志物的灵敏度及特异度。通过MedCalc软件对ROC曲线进行对比。P<0.05为差异有统计学意义。
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结果2.1 一般临床资料 50例接受allo-HSCT患儿，男39例，女11例，中位年龄8.5（1~13）岁。观察组有17例肠道aGVHD患儿，肠道aGVHD发生中位时间为移植后第36（18-78）天。其余33例未发生肠道aGVHD患儿作为对照组，取移植后第35天3种生物蛋白检测值与观察组比较。2组患儿性别、年龄、中性粒细胞植入时间、原发疾病类型、供者来源差异均无统计学意义（均P>0.05），患儿均植入成功（表1）。
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讨论近些年来，随着allo-HSCT技术的不断成熟和预处理方案的优化，allo-HSCT已在临床广泛开展。aGVHD是移植后的常见并发症和主要致死原因，尤其肠道aGVHD，一旦进展为Ⅲ～Ⅵ级肠道aGVHD，往往病情危重、治疗棘手、花费高昂，严重影响移植后患儿的生存质量。临床中对肠道aGVHD的诊断仍主要基于临床症状和创伤性黏膜活检，但是这种诊断模式存在诸多弊端，无法在临床症状出现前早期预警肠道aGVHD的发生。同时，因肠道aGVHD与其他因素（药物、预处理毒性、感染等）造成的腹痛、腹泻、便血等临床表现相似，常难以鉴别，诊断困难。目前临床中缺乏诊断肠道aGVHD的特异性及敏感性指标。因此寻找肠道aGVHD相关生物标志物以早期预警、辅助诊断和疗效评估，已成为临床研究的热点和难点。REG3α主要由小肠隐窝中的Paneth细胞分泌，其作为一种抗菌蛋白可起到保护肠黏膜的作用。严重的肠道aGVHD引起肠黏膜上皮屏障破坏，使REG3α可以从肠腔进入体循环中［7］。sST2由内皮细胞、上皮细胞和成纤维细胞在炎症刺激下分泌到血液中［8］，其作为白细胞介素-33（IL-33）［9］ 的配体，驱动2型辅助性T淋巴细胞（Th2）向1型辅助性T淋巴细胞(Th1)表型转化，在aGVHD病理生理过程起到重要作用。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是由单核细胞、巨噬细胞以及活化的供体T淋巴细胞分泌的一种炎性因子［10］，TNFR1是TNF-α的受体之一，TNF-α与TNFR1在细胞表面结合后的复合物容易在血液中检测到［11］。虽然近二十年来已经发现多种分子或蛋白与aGVHD相关，但到目前为止还没有可靠的生物标志物用于临床。本研究通过Luminex平台动态检测移植患儿外周血中REG3α、sST2、TNFR1 的表达水平，发现并发肠道aGVHD患儿外周血中REG3α、sST2、TNFR1表达水平较无肠道aGVHD患儿显著增高（P<0.05），提示此3种生物蛋白可能参与肠道aGVHD的发病机制。Ferrara等［12］报道移植后的1 014例成人肠道GVHD患者REG3α的水平是无肠道GVHD患者的3倍，本研究中肠道aGVHD患儿REG3α的水平是无肠道aGVHD患儿的3.75倍，与文献报道的成人结果相似。Ponce等［13］通过检测113例成人患者移植后第28天外周血中sST2表达水平，发现sST2高表达水平与aGVHD严重程度相关。Choi等［14］通过检测438例移植患者术后第1周TNFR1水平的变化，发现TNFR1表达水平与aGVHD的严重程度相关。结合上述文献报道及本研究结果，本研究认为REG3α、sST2、TNFR1与肠道aGVHD的发生发展密切相关，可作为肠道aGVHD的生物标志，其灵敏度及特异度需做进一步研究。经ROC曲线分析显示，REG3α、sST2对肠道aGVHD 具有较大的诊断价值，尤其是二者联合检测的灵敏度、特异度高达83%、99%，大于单独指标检测的意义（P<0.05）。进一步统计分析得出，REG3α和sST2对于诊断肠道aGVHD的截断值分别为16 143.0 ng/L、42 203.5 ng/L，建议临床中动态监测REG3α、sST2水平，据此调整抗排异治疗策略，若早期肠道aGVHD临床特征不典型时，监测二者水平明显升高尚未达到截断值时，需高度警惕肠道aGVHD即将发生，可加强抗排异药物，有望避免不良结果的发生。对于已有肠道aGVHD临床症状但难以确诊的，监测二者水平有助于鉴别诊断，如果达到或超过诊断截断值，高度倾向诊断肠道aGVHD。目前临床中也缺乏评估临床疗效的客观指标。本研究发现肠道aGVHD治疗有效患儿的外周血中REG3α、sST2表达水平较治疗前显著降低（P<0.05），而治疗无效组患儿3种生物蛋白较治疗前整体呈升高趋势，差异均无统计学意义（均 P>0.05），提示REG3α、sST2表达下降可能是治疗有效的生物标志。Major-Monfried等［15］研究发现激素治疗耐药患者外周血中REG3α、sST2显著高于激素敏感患儿，二者高表达是预后不良的危险因素，二者表达下降预示治疗有效。以上研究结果揭示REG3α、sST2有望作为评估肠道aGVHD临床疗效的客观生物指标，REG3α、sST2持续高表达可能提示预后不佳。但本研究样本量偏小，可能存在偏倚，有待扩大样本量进一步验证。综上所述，探究与肠道aGVHD发生机制相关的炎症因子及肠黏膜损伤相关蛋白，筛选出具有协助临床诊断和疗效评估的生物标志物，具有重要的临床意义。REG3α、sST2有望成为诊断肠道aGVHD的潜力生物蛋白，也可作为肠道aGVHD临床疗效评估的客观指标。本研究为单中心研究，存在样本量少等不足，需进一步开展多中心、大样本数据研究来进一步证实。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
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