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作者：林馨 王珏 林志 陈琅 陈巧彬 林萌 郭馨馨 吴菲菲通信作者：王珏，Email：nonglover@yeah.net作者单位：福建医科大学省立临床学院，福建省立医院儿科， 福州 350001本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(15):1151-1155.引用本文：林馨,王珏,林志,等.不明病因早发癫痫性脑病的遗传学及早期诊断研究[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(15):1151-1155.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20210604-00638.
摘要
目的 探究病因不明的早发癫痫性脑病（EOEE）的遗传学病因及其在早期诊断中的价值。方法 前瞻性收集2018年1月至2021年1月就诊于福建省立医院门诊及住院部的60例病因不明的EOEE患儿的资料，采集外周血进行全外显子组测序及拷贝数变异（CNV）检测，分析患儿临床特点、遗传学测序结果。结果 检测出EOEE相关的致病或可疑致病突变24例，包括婴儿痉挛症（10例）、Dravet综合征（3例）、吡哆醇依赖性癫痫及大田原综合征（各1例）、非已知癫痫性脑病（9例）。患儿起病年龄1 d～11个月（中位年龄4.2个月），就诊年龄2 d～4岁（中位年龄10个月），确诊年龄均控制在就诊1个月以内。发现单基因变异20例（33.3%），CNV 4例（6.7%）；涉及13种基因：KCNQ2、SCN1A、SCN8A、CACNA1E、CDKL5、PPP3CA、PCDH19、TSC1、TSC2、ZEB2、ALDH7A1、DCX、HNRNPU；4例CNV异常分别为17p13.3缺失、11q23.3q25缺失、1q36.31-p36.33缺失、1q43-1q44 缺失合并Xp22.33重复；共20种变异为国内外首次报道的新发位点；11q23.3q25缺失导致婴儿痉挛症为国内外首次报道；ZEB2变异导致婴儿痉挛症、PPP3CA基因导致癫痫性脑病均系国内首例报道。结论 基因与CNV是EOEE患儿的重要潜在病因，病因不明时联合采用全外显子组测序和CNV测序技术检测，可提高 EOEE 患儿的遗传学病因诊断水平；对此类患儿早期进行遗传学检测，可以早期确诊及进行癫痫精准治疗。
关键词
癫痫性脑病，早发;全外显子组测序;拷贝数变异
早发癫痫性脑病（early onset epilepticencephalopathy,EOEE）指一组在婴儿期起病的难治性癫痫，由于频繁的癫痫发作或癫痫放电导致严重认知和行为障碍、精神运动发育迟缓；包括早期肌阵挛脑病、大田原综合征、婴儿癫痫伴游走性局灶性发作、婴儿痉挛症(IS)、Dravet综合征、非已知的癫痫性脑病等［1］；EOEE是预后最差的癫痫性脑病，基因突变是EOEE的重要病因［1］。基于此，本研究结合全外显子和全基因组拷贝数变异测序（copy number variations sequencing，CNV-seq）技术对60例不明原因的EOEE患儿进行基因变异检测，以期早期确诊及进行癫痫精准治疗。
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资料与方法1.1 临床资料 前瞻性收集2018年1月至2021年1月就诊于福建省立医院门诊及住院部的60例病因不明的EOEE患儿详细资料，包括年龄、性别、起病年龄、家族史、围生史、生长发育史、发作形式、有无畸形、颅脑磁共振成像（MRI）、动态或视频脑电图、基因检测结果、血氨、乳酸、生化、血尿串联质谱筛查、治疗经过等。发育评估采用婴幼儿神经心理发育诊断量表，以末次评估为准；门诊或电话随访，至少随访6个月以上。本研究通过医院医学伦理委员会批准（批准文号：K201901015），患儿监护人均签署知情同意书。1.2 纳入标准 （1）符合国际抗癫痫联盟(ILAE)制定的癫痫性脑病标准［2］；（2）出生12个月内癫痫发作；（3）有多种癫痫发作类型；（4）常规抗癫痫药物难以控制发作；（5）认知功能、运动功能发育迟滞或倒退；（6）病因不明。除外代谢性疾病、围生期脑损伤、颅内感染等已知病因的患儿。1.3 全外显子和CNV-seq检测方法 全外显子测序方法：取患儿外周静脉血2 mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，提取DNA，样品检测及打断，构建文库，目的基因的捕获及富集，生物信息学分析，检索人类基因突变数据库（HGMD）、PubMed、Clinvar等数据库，参考《美国医学遗传学和基因组学学会变异分类指南》［3］对变异进行分类。CNV-seq检测方法：采集患儿外周静脉血2 mL，EDTA抗凝，提取DNA，测定浓度，构建DNA文库，应用NEXTSEQ 50测序仪上机测序，数据分析与计算，得出显著的拷贝数变异（CNV），在人类表型本体论（HPO）数据库中搜索以匹配相似的表型，同时进行定量聚合酶链反应（qPCR）实验排除二代测序的假阳性。最后采用Sanger测序验证父母及来源分析，以上检测均委托武汉康圣达医学检测所完成。
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结果2.1 临床特点 60例EOEE患儿基因诊断明确24例（40.0%），其中男、女各12例，起病年龄1 d～11个月（中位年龄4.2个月）；就诊年龄2 d～4岁（中位年龄10个月）。IS 10例，Dravet综合征3例，吡哆醇依赖性癫痫1例，大田原综合征1例，非已知癫痫性脑病9例。6例有热性惊厥史（例3、6、12、14、18、23）；家族史：热性惊厥史2例（例5大伯及祖父、例14父亲），癫痫病史4例（例18姐姐、例19外祖母、例13母亲、例22兄长）。24例患儿母孕史均未见明显异常。发作形式多样，以全面性强直阵挛、痉挛发作多见。治疗药物均为2种或以上，其中大部分未控制，仅例24发作控制。24例患儿在发病前后均存在不同程度的智力运动发育落后。2.2 颅脑MRI和脑电图结果 MRI正常11例，异常13例，分别为左右侧脑室内多发实体占位、皮质下层状异位、先天性无脑回畸形、胼胝体缺如各1例，室管膜下囊肿1例、脑积水8例。脑电图显示暴发抑制1例、典型或不典型高度失律伴或不伴多灶性棘（尖)慢波10例、多灶性棘（尖)慢波13例。2.3 全外显子组测序和CNV-seq检测结果 共检测出24种致病或可能致病基因变异，涉及13种基因，包括SCN1A、SCN8A、CACNA1E、CDKL5、PPP3CA、PCDH19、TSC1、TSC2、ZEB2、ALDH7A1、DCX、KCNQ2、HNRNPU，其中错义突变14例，移码突变4例，杂合缺失1例；15例为新生突变，5例为遗传性突变；15种变异位点既往国内外未见报道。其中单基因变异20例（33.3%,20/60例），4例（6.7%,4/60例）患儿共检出5种CNV异常，例23同时存在2种CNV变异，均为致病性变异。共20种为未报道的新发位点，11q23.3q25缺失导致IS为国内外首次报道，ZEB2变异导致IS、PPP3CA基因导致癫痫性脑病均系国内首例报道。患儿基因检测结果见表1、2。
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讨论基因与CNV是EOEE的重要潜在病因［4］。本组资料60例EOEE患儿基因诊断明确24例（40.0%），其中单基因变异20例（33.3%），CNV变异4例（6.7%），检测结果与既往报道基本符合［5］；共检出13种单基因变异,其中15处变异位点和5种CNV变异既往国内外文献均未见报道。IS是婴幼儿期最常见的年龄特异性癫痫性脑病，本资料中10例IS患儿有3例存在TSC基因变异，例1同时存在TSC1、TSC2突变，胞姐是TSC1杂合变异，均遗传自父亲；其父仅面部有皮脂腺瘤，姐姐表型正常，同时存在TSC1、TSC2突变文献报道十分少见；3例患儿诊断结节性硬化症（TSC）临床标准均不足，均通过基因确诊，TSC是最常引起IS的神经皮肤疾病。本研究中与IS相关的基因还有SCN8A、ZEB2、HNRNPU、DCX等，其中SCN8A基因以新发变异为主，极少数遗传，表型异质性强［6］。例9患儿9月龄时出现痉挛发作，起病前发育正常，起病后发育轻度落后，脑电图可见高峰失律，确诊IS，行全外显子联合CNV检测出系SCN8A基因杂合错义突变，遗传自有癫痫病史的父亲，其父幼年起病，语言表达稍差，智力大致正常，目前同时服用卡马西平和拉莫三嗪，偶有发作。ZEB2基因突变可导致Mowat-Wilson综合征（MWS），表现为难治性癫痫、发育落后、特殊面容、多脏器畸形、先天性巨结肠症等［7］；由于基因的大片段缺失、移码或无义变异导致单倍体剂量不足而致病，错义突变少见［8］。例15系ZEB2基因新生无义突变（c.2456C>G，p.Ser819X），表型为IS，ZEB2变异导致IS十分少见，本例是国内首次报道。例20为HNRNPU移码突变（p.Arg224Glyfs*11），是23个碱基对缺失的结果，最终导致翻译提前终止。HNRNPU基因的大片段缺失与智力低下和癫痫发作相关，目前国内外报道大部分为染色体片段微缺失部分含有该基因缺失，资料中例23就检出2处CNV异常，即1q43-1q44缺失和Xp22.339重复，缺失区域包括EOEE的致病基因HNRNPU；患儿表现为精神发育迟滞、特殊面容、小角膜、胼胝体异常等，与文献报道［9-10］相符。HNRNPU基因点突变少见，几乎所有患儿均在出生1年内起病，多有热敏感性，表现为痉挛发作，大多早期有精神运动发育落后。DCX为X连锁基因，此类基因变异对男女患者的影响不同。女性DCX基因变异表现为典型的双皮质综合征，男性则为无脑回畸形［11］；女性患病与X染色体随机失活有关；男性表型更重，早期出现严重的认知、语言障碍和癫痫发作等症状［12］。例14系DCX基因错义突变女性患儿，表型为IS、皮质下层状灰质异位。资料中与X连锁相关的基因还有CDKL5、PCDH19，CDKL5基因变异女性患病率高，男女表型严重程度无明显差异［13］。例11女童系CDKL5基因新发移码突变（c.1993_1996del），出生1个月出现癫痫发作，发作频繁、多种发作形式，6个月时不会追光追物、不会抬头、仅发声。研究发现［13］CDKL5相关IS患儿接受促皮质素（ACTH）治疗后易出现频繁惊厥发作，此类患儿应慎用ACTH。另外在诊断为非已知癫痫性脑病的患儿中发现存在PPP3CA基因突变，目前国内未见相关报道，该基因突变导致婴儿或儿童早期癫痫性脑病1型［14］；例16系PPP3CA基因新发杂合移码缺失（c.1255_1256delAG),患儿2个月时出现癫痫发作，包括局灶性、阵挛性、全面性强直阵挛等多种发作形式，目前4岁，不会说，不会抬头，仅发声、没有语言，肌张力低，预后很差。例17系CACNA1E基因错义突变，表型为难治性癫痫、严重肌张力减退及发育落后。CACNA1E功能获得性变异是导致EOEE的主要原因［15］，阻断R型钙电流是开发CACNA1E相关癫痫精准药物的一个有希望的靶点。除外以上的单基因变异，还发现4例CNV变异患儿，主要表型包括精神运动发育迟滞、特殊的颅面特征、多脏器畸形、难治性癫痫等。例21系17p13.3缺失，内含LIS1等基因，LIS1缺失可导致Miller-Dieker综合征（MDS）［16］，该患儿有发育落后、肌张力异常、无脑回畸形、IS等，符合MDS［16］。例22系11q23.3q25缺失，缺失区域中的FLI1基因参与血管和巨核细胞的分化，缺失可导致血小板减少，该患儿表现为发育落后、IS、血小板减少等；此综合征还可有癫痫发作，但表型为IS系首次报道［17］；例23缺失区域包括EOEE的致病基因HNRNPU。例24系与1p36缺失综合征相关，此类缺失综合征多数有癫痫发作，以IS最常见［18］。该患儿表型为追光追物差、癫痫、手指畸形等。除病例23外，其余3例均缺乏典型的颅面部特征考虑与年龄小有关。传统方法如临床症状、头颅MRI和遗传代谢检测等对癫痫性脑病的病因诊断率<13%，二代靶向测序可将诊断率提高至30%左右［19］。本研究联合全外显子和CNV对EOEE进行检测，基因变异阳性率33.3%，CNV阳性率6.7%，总阳性率达40.0%；联合CNV检测可提高EOEE病因的检测阳性率，与既往文献报道一致［5，19-20］。一项回顾性文献报道显示，癫痫性脑病患儿的起病年龄（27.23±44.05）个月（7 d～15岁），均通过基因检测确诊，确诊年龄（6.8±4.7）年（5个月～17岁）［19］；本研究中患儿就诊年龄2 d～4岁（中位年龄10个月），就诊后立即进行基因检测，检测耗时20个工作日，患儿的确诊年龄可控制在就诊1个月以内，即1个月～4岁1个月（中位年龄11个月），确诊年龄明显小于上述报道年龄。另有研究显示，早期对EOEE患者进行基因测序，不仅可将诊断年龄提前，并有助于早期精准治疗、减少医疗支出，具有显著的临床效益和成本效益［21］。本研究连同上述文献报道为基因测序在EOEE早期诊断中的临床应用价值提供了有力的证据。本研究对不明原因EOEE联合采用全外显子组和CNV-seq技术检测，丰富了EOEE的基因型，提高了EOEE 的病因诊断水平；对这类患儿早期进行遗传学检测，可以早期确诊，避免不必要的后续检查并有助于癫痫精准治疗、判断预后及再生育指导。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
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