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作者：魏铭 任洁 詹迪 彭惠临 张偲 罗小平通信作者：张偲，Email:caizhang@tjh.tjmu.edu.cn作者单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科，武汉 430030本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(17):1336-1340.引用本文：魏铭,任洁,詹迪,等.孕期增重过多对胎鼠肝脏脂质代谢的影响及机制研究[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(17):1336-1340.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20210705-00772.
摘要
目的 构建孕期增重过多（EGWG）大鼠模型，探讨EGWG对胎鼠肝脏脂质代谢的影响及机制。方法 健康SD大鼠合笼验孕，显微镜观察到精子视为孕0.5 d。采用随机数字表法将孕鼠分为正常饮食（ND）组和高脂饮食（HFD）组，每组8只，记录孕鼠孕期体质量。于孕21.5 d行剖宫产手术，记录胎鼠出生体质量。苏木精-伊红（HE）染色、油红O染色观察孕鼠、胎鼠肝脏脂质沉积，甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶（GPO-PAP）法检测孕鼠、胎鼠肝脏与血清三酰甘油（TG）、胆固醇（TC）水平，实时荧光定量PCR（RT-PCR）和Western blot检测胎鼠肝脏脂质代谢关键基因FASN、SREBP1c的mRNA表达水平和蛋白表达水平。采用独立样本t检验进行两组间数据比较。结果 HFD组与ND组大鼠孕前体质量无差异，孕期体质量及孕期增重差异逐渐明显。孕21.5 d，HFD组孕鼠体质量［（467.75±22.05） g比（430.88±18.80） g，t=-3.600，P=0.003］、孕期增重［（181.50±9.68） g比（148.50±10.86） g，t=-6.415，P<0.001］、胎鼠体质量［（5.51±0.17） g比（4.85±0.35） g，t=-4.779，P<0.001］均较ND组显著增加。HE染色、油红O染色均提示HFD组孕鼠、胎鼠肝脏脂质沉积加重。HFD组孕鼠、胎鼠肝脏与血清TG、TC水平均较ND组显著升高（均P<0.05）。RT-PCR和Western blot结果显示，HFD组胎鼠肝脏脂质代谢关键基因FASN、SREBP1c的mRNA表达水平和蛋白表达水平均较ND组显著升高（均P<0.05）。结论 孕21 d HFD可成功构建EGWG动物模型，孕鼠EGWG可导致胎鼠肝脏脂质沉积，其机制可能与胎鼠肝脏脂质代谢关键基因FASN、SREBP1c的表达改变有关。
关键词
胎鼠；孕期增重过多；肝脏脂质代谢
妊娠期肥胖不仅会危害孕母健康，导致妊娠期糖尿病、先兆子痫等并发症，还会对子代的肥胖易感性、胰岛素敏感性等产生长期影响［1-3］。根据体质量增加的时期，妊娠期肥胖分为孕前肥胖与孕期增重过多（excessive gestational weight gain，EGWG）［4］。研究表明，中国女性孕前肥胖的发病率为16%，而EGWG的发病率高达57.9%［5-6］。已有多项研究证实，EGWG是引起子代儿童期及成年后肥胖的重要独立危险因素，对子代健康有深远的不良影响［7-8］。因此，明确EGWG导致儿童肥胖的机制并寻找有效的治疗方法是亟待解决的难题。目前关于EGWG导致子代肝脏代谢异常的研究较少，亦缺少通用的单纯EGWG动物模型。妊娠期肥胖动物模型主要通过孕前或孕前、孕期全程高脂饲料喂养等方法构建，但此类建模方法均混杂有孕前肥胖对子代代谢的影响，均不适用于单纯EGWG相关的机制研究。为了探讨EGWG对子代代谢的影响，本研究构建了EGWG的大鼠模型，并分析EGWG对子代肝脏脂质代谢的影响及可能的机制，以期为EGWG相关胎源性疾病的研究提供基础。
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材料与方法1.1 实验动物及试剂 8周龄清洁级SD大鼠，雌性16只，雄性8只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2016-0006。饲养于实验动物中心无特殊病原体（SPF）实验室，予12 h/12 h昼夜光照，温度20~26 ℃，湿度40%~70%，自由饮水，采用随机数字表法将实验动物分组，并给予相应饮食。60%高脂饲料（江苏美迪森生物科技有限公司）；三酰甘油（TG）、胆固醇（TC）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR SYBR Green试剂、β-actin抗体、山羊抗兔二抗（上海翌圣生物科技股份有限公司）；40 g/L多聚甲醛、放射性免疫沉淀分析(RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒、蛋白上样缓冲液、增强化学发光（ECL）曝光液（武汉博士德生物工程有限公司）；脂肪酸合酶（FASN）抗体（美国CST公司）；胆固醇调节元件结合蛋白1c（SREBP1c）抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司）。本研究已通过华中科技大学同济医学院附属同济医院伦理委员会的批准（批准文号：TJ-A20190801），实验过程中所有操作遵守伦理委员会发布的伦理及管理指南。1.2 妊娠期肥胖动物模型的建立 健康8周龄SD大鼠适应性喂养1周后，按雌雄2∶1合笼，次晨阴道涂片验孕，显微镜观察到精子视为孕0.5 d。受孕成功后，孕鼠立即按随机数字表法分为2组：正常饮食（ND）组和高脂饮食（HFD）组，每组8只。ND组给予正常饲料，HFD组给予60%高脂饲料，孕鼠每周监测体质量。孕21.5 d孕鼠禁食12 h，100 g/L水合氯醛麻醉后行剖宫产手术，记录胎鼠出生体质量。留取孕鼠、雄性胎鼠血清及肝脏组织。孕鼠剖宫产术后暴露心脏取血，胎鼠断头取血。部分肝脏组织固定在40 g/L多聚甲醛，留待组织切片；部分肝脏组织液氮速冻后，保存于-80 ℃冰箱，用于后续实验。1.3 肝脏HE染色 新鲜的肝脏组织在40 g/L多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋后切片。石蜡切片脱蜡水化，HE染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察。1.4 肝脏油红O染色 肝脏冷冻切片干燥复温10 min，600 g/L异丙醇漂洗15 s，油红O染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察。1.5 肝脏、血清TG、TC水平检测 肝脏组织样本研磨后提取上清用于检测。在96孔板设置标准孔、样本孔和空白孔，依次加入2.5 μL的标准品、蒸馏水、肝脏提取液或血清样本，后迅速加入250 μL工作液，混匀，37 ℃”孵育10 min，波长510 nm，酶标仪测定各孔A值，根据说明书，计算肝脏、血清的TG、TC水平。1.6 实时荧光定量PCR(RT-PCR) 使用Primer Premier 6和Oligo 7进行引物设计和验证，交由擎科生物科技有限公司合成。FASN正向引物：5′-GCTGCTACAAACAGGACCATC-3′，反向引物：5′-TCCACTGACTC-TTCACAGACCA-3′；SREBP1c正向引物：5′-AGACAAACT-GCCCATCCACC-3′，反向引物：5′-AAGCGGATGTAGT-CGATGGC-3′；β-actin正向引物：5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCT-3′，反向引物：5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCT-3′。利用RNA提取试剂盒提取肝脏组织RNA，分光光度计检测RNA浓度及纯度。根据反转录试剂盒说明，冰上配制反转录反应体系。反转录仪将RNA反转录为互补脱氧核糖核酸（cDNA）后，冰上配制PCR反应体系：PCR SYBR Green 5 μL，上下游引物各0.2 μL，cDNA 1 μL，双蒸水（ddH2O） 3.6 μL；PCR反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火/延伸30 s，40个循环。根据得到的Ct值，利用2”-△△Ct计算分析，得到相对定量的结果。1.7 Western blot检测 采用RIPA裂解液提取组织蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。制备分离胶和浓缩胶，按30 μg蛋白上样量进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），后转膜至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。50 g/L脱脂牛奶室温封闭60 min。稀释后的一抗（均1∶1 000稀释）4 ℃孵育过夜，洗膜缓冲液（TBST）洗膜3次，稀释后的二抗（1∶5 000稀释）室温孵育60 min，TBST洗膜3次。ECL曝光液在凝胶成像分析仪中曝光显影，Image Lab软件分析目的蛋白和内参的灰度值。1.8 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，计量资料正态分布以x̄±s表示，两组数据间比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
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结果2.1 EGWG大鼠模型构建 HFD组与ND组孕鼠孕前体质量无差异；孕14.5 d开始，HFD组孕鼠体质量［（379.38±16.74） g］较ND组［（351.50±18.38） g］明显增加，差异有统计学意义（t=-3.171,P<0.05）；至孕21.5 d，HFD组孕鼠体质量［（467.75±22.05） g比（430.88±18.80） g，t=-3.600，P=0.003］、孕期增重［（181.50±9.68） g比（148.50±10.86） g，t=-6.415，P<0.001］、胎鼠体质量［（5.51±0.17） g比（4.85±0.35） g，t=-4.779，P<0.001］均较ND组显著增加（图1）。提示孕期21 d高脂饮食可成功构建EGWG大鼠模型。
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讨论本研究成功构建了EGWG的大鼠模型，证实孕期21 d 60% HFD可导致大鼠EGWG、胎鼠出生体质量增加。进一步研究表明EGWG可导致胎鼠肝脏脂质沉积，表现为TG、TC水平升高，推测可能与胎鼠肝脏脂质代谢关键基因FASN、SREBP1c的表达改变有关。随着胎儿的不断生长，孕妇体质量通常会逐渐增加。孕期增加的体质量主要来源于三部分，其中50%左右来源于胎儿胎盘单位（胎儿、胎盘、羊水、子宫），25%左右来源于增加的血管内外体液和乳房组织，剩余部分来源于母体脂肪、蛋白质等物质的积累［8］。众多流行病学研究表明EGWG对子代健康有着深远影响：EGWG孕妇子代巨大儿、儿童期肥胖的发病率增加，成年后发生心血管疾病（高血压）及代谢性疾病（血脂异常、胰岛素抵抗）的风险增加［9-10］。鉴于孕期增重对子代健康的深远影响，2009年美国医学研究所发布了关于孕期增重的相关指南，并建议孕前体质量指数（BMI）正常的育龄妇女孕期增重控制在11.5~16.0 kg［11］。但目前关于EGWG对子代健康影响的机制研究较少，也缺少明确的EGWG动物模型。目前妊娠期肥胖动物模型的构建方法主要集中在孕前或孕前孕期全程HFD等方面，单纯EGWG的动物模型并不多见。Wang等［12］利用孕前孕期全程高脂饲料喂养的小鼠作为妊娠期肥胖的动物模型，发现母体妊娠期肥胖可通过抑制肌生成及棕色脂肪生成影响胎鼠棕色脂肪组织发育。但由于该项研究使用的动物模型包括孕前肥胖、孕期增重2种因素，并不能明确EGWG在其中的具体作用。Cortés-lvarez等［13］仅在孕期对大鼠进行高脂饲料喂养，但高脂组孕鼠孕期体质量并无明显增加。进一步比较发现，该研究中使用的动物模型为Wistar大鼠，且高脂饲料中脂肪比例仅有42%，以上动物品系、高脂饲料脂肪含量的差别可能导致孕鼠孕期增重情况与本研究不同。因此，Wistar大鼠孕期42%高脂饲料喂养亦不适合作为EGWG动物模型。另有部分研究利用猪进行EGWG模型构建。虽然猪与人类的生理结构和代谢调控相似，但其体型较大，且成本高，耗费人力财力，不易推广应用［14］。本研究利用60%高脂饲料喂养孕期SD大鼠，HFD组孕鼠孕期增重明显，子代围生期体质量显著增加，与人类研究中EGWG孕妇子代大于胎龄儿、巨大儿发病率增加一致。综上所述，本研究构建的动物模型符合人类EGWG的临床特点，可作为EGWG较为理想的动物模型，为深入探讨母胎代谢调控机制提供了研究基础。胎儿肝脏作为母体血液进入胎儿体内的“第一站”，被认为是母体因素对胎儿影响的“哨点”器官［15-16］。因此，观察EGWG对子代肝脏代谢的影响、探究其中的调控机制是研究EGWG中子代代谢改变的重要环节。本研究中，EGWG的子代肝脏脂质沉积显著，其中TG水平升高最为明显。TG是由长链脂肪酸和甘油形成的脂肪分子。脂肪酸合酶FASN是脂肪从头合成中的重要调节酶，包含7个活性位点，参与乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A从头合成棕榈酸酯的所有催化步骤，在长链脂肪酸的从头合成中发挥重要作用［17-18］。SREBP1c调节参与脂肪酸合成的基因转录，是重要的转录调控因子，SREBP1c的激活使脂质合成相关基因表达量显著上调，同时脂肪酸从头合成及摄取速率显著增加［19-20］。本研究中，HFD组胎鼠肝脏FASN、SREBP1c的mRNA水平及蛋白水平均高于ND组，EGWG导致子代肝脏脂质沉积明显加重，考虑与FASN、SREBP1c介导的脂质代谢相关。其中的深入机制仍有待进一步探讨，可能与营养过剩的宫内环境诱导的表观遗传学调控有关，如DNA甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA等［21］。总之，本研究利用孕期21 d 60%高脂饲料喂养SD孕鼠，成功构建了EGWG动物模型，并发现EGWG可导致胎鼠肝脏脂质沉积显著，而FASN与SREBP1c可能在EGWG相关的子代肝脏脂质代谢异常中起着重要的调控作用。本研究构建的动物模型以及对母胎代谢调控的探讨，为后期进一步深入的机制研究建立了基础。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
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