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作者：刘燕飞1 严小松1 惠军朋1 张娜1 张鑫1 王哲2 杨丽2通信作者：杨丽,Email：yangl1110@163.com作者单位：1西安市儿童医院病理科,西安 710003；2空军军医大学西京医院病理科，西安 710032本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(10):763-767.引用本文：刘燕飞,严小松,惠军朋,等.白血病病毒整合基因1、NKX2.2在儿童骨外尤文肉瘤病理诊断中的价值[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(10):763-767.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20210309-00275.
摘要
目的 探讨白血病病毒整合基因1 (FLI1)、NKX2.2在儿童骨外尤文肉瘤病理诊断及与其他小圆细胞肿瘤鉴别诊断中的价值。方法 回顾性分析西安市儿童医院和空军军医大学西京医院病理科2014年1月至2020年12月诊断的儿童骨外尤文肉瘤及其他小圆细胞肿瘤病例资料，采用免疫组织化学染色法观察FLI1、NKX2.2的表达情况。结果 1.骨外尤文肉瘤27例；其他小圆细胞肿瘤145例，包括分化差型及未分化型神经母细胞瘤40例，横纹肌肉瘤34例，胚芽为主型肾母细胞瘤30例，淋巴瘤25例，恶性横纹肌样瘤10例，髓系肉瘤2例，促纤维增生性小圆细胞肿瘤1例，BCOR重排肉瘤1例，CIC重排肉瘤1例，婴儿黑色素性神经外胚瘤1例。2.FLI1在骨外尤文肉瘤中的敏感性为88.9%（24/27例），特异性为5.5%（8/145例），阳性预测值为14.9%（24/161例），阴性预测值为72.8%（8/11例）；NKX2.2在骨外尤文肉瘤中的敏感性为92.6%（25/27例），特异性为97.9%（142/145例），阳性预测值为89.3%（25/28例），阴性预测值为98.6%（142/144例）;FLI1和NKX2.2联合检测的敏感性为85.2%，特异性为97.9%，阳性预测值为88.5%，阴性预测值为97.3%。结论 NKX2.2在儿童骨外尤文肉瘤中有较高的敏感性和特异性，可作为一线抗体用于其诊断和鉴别诊断；FLI1敏感性高，但特异性差，可作为一线抗体用于诊断，但在鉴别诊断时应联合其他抗体以及分子检测，以免误诊。
关键词
尤文肉瘤，骨外；免疫组织化学；白血病病毒整合基因1；NKX2.2；鉴别诊断
骨外尤文肉瘤（extraskeletal Ewing′s sarcoma,E-EWS）是一种高度恶性的软组织肿瘤，好发于15~30岁青少年和年轻人［1-2］，儿童少见。形态学上E-EWS属于小圆细胞肿瘤，与好发于儿童的多种肿瘤形态相似，尤其当活检组织量非常少时，病理诊断常很困难。目前，CD99是尤文肉瘤诊断使用的一线免疫标志，但其特异性差，在淋巴造血系统肿瘤［3］、横纹肌肉瘤（rhabdo-myosarcoma，RMS）、CIC重排肉瘤［4］等儿童常见肿瘤中广泛表达。近年来，陆续有学者发现白血病病毒整合基因1（friend leukaemia integration-1，FLI1）［5］、NKX2.2［6］有助于E-EWS的诊断。国外对这2种抗体的报道较多［7-8］，但缺乏在恶性横纹肌样瘤（malignant rhabdoid tumor,MRT）、婴儿黑色素性神经外胚瘤（melanotic neuroectodermal tumor of infancy，MNTI）等少见肿瘤中的报道。国内鲜有研究，尤其缺乏儿科肿瘤的大宗报道。本研究筛选出27例儿童E-EWS及其他145例儿童小圆细胞肿瘤病例，观察FLI1、NKX2.2的表达情况，探讨二者在儿童E-EWS病理诊断及鉴别诊断中的价值。
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资料与方法1.1 研究对象 回顾性分析。收集西安市儿童医院、空军军医大学西京医院病理科2014年1月至2020年12月诊断的儿童（14岁以下）E-EWS及其他小圆细胞肿瘤病例，标本经100 g/L中性甲醛固定，4 μm石蜡切片，HE染色，由2位高年资主治医师复片筛选,并进行分析。本研究通过西安市儿童医院医学伦理委员会批准（批准文号：2020040g-3），患儿监护人均知情同意。1.2 病例筛选标准 （1）E-EWS病例免疫组织化学染色CD99弥漫膜阳性，FLI1和/或ERG核阳性，神经内分泌相关标志至少1项阳性，肌源性、黑色素标志阴性，荧光原位杂交（FISH）检测显示EWSR1断裂重排，未行相关的融合基因检测。（2）神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）为肾上腺占位或后纵隔占位病例，分化差的病例镜下可见节细胞分化及神经纤维丝，免疫组织化学染色突触素、酪氨酸羟化酶阳性，CD99及横纹肌标志阴性，未分化的病例遗传学检测有N-MYC扩增或1p或11q异常。（3）肾母细胞瘤(Wilms tumor,WT)为肾脏占位，肿瘤镜下可见胚芽、间质及上皮3种成分，其中胚芽成分比例>66%，且肾母细胞瘤蛋白1为核阳性表达。（4）RMS病例为结蛋白、Myogenin、MyoD1阳性病例，腺泡状RMS病例FISH检测显示FOXO1基因断裂重排。（5）淋巴母细胞性淋巴瘤（lymphoblastic lymphoma，LL）病例表达T/B淋巴细胞标志，同时末端脱氧核苷酸转移酶（TDT）弥漫阳性。（6）伯基特淋巴瘤（Burkitt lymphoma,BL）病例表达生发中心B淋巴细胞标志，FISH检测有C-MYC断裂重排，无BCL-2、BCL-6重排。（7）MRT病例至少局灶有典型形态学表现，肌源性标志阴性，INI1蛋白表达缺失。（8）促纤维增生性小圆细胞肿瘤（desmoplastic small round cell tumor，DSRCT）组织形态典型，免疫组织化学呈双向分化且结蛋白呈特征性的核旁阳性，FISH检测EWSR1断裂重排。（9）CIC重排肉瘤FISH检测到CIC基因断裂重排，同时未检测到EWSR1断裂重排。（10）BCOR重排肉瘤FISH检测有BCOR断裂重排。（11）MNTI具有典型的肉眼所见，镜下由未分化的小蓝圆细胞和色素上皮细胞构成。1.3 免疫组织化学染色及判读标准 3 μm连续切片。所用抗体及相关试剂购自北京中杉金桥公司。NKX2.2、FLI1克隆号分别为EP336、G146-22。FLI1以阑尾血管内皮为阳性对照，肠黏膜为阴性对照；NKX2.2以胰腺胰岛为阳性对照，导管为阴性对照。结果由2位高年资主治医师判读，阳性标准均为肿瘤细胞核阳性。按阳性表达占肿瘤细胞的百分比分为4种：>70%阳性为弥漫阳性“+++”，30%~ 70%为部分阳性“++”，<30%为灶状阳性“+”，无肿瘤细胞阳性为阴性“-”。1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，阳性率比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
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结果2.1 肿瘤类型 筛选出E-EWS病例27例（图1A）。年龄4个月~13岁，中位年龄8岁；男16例，女11例；发生于脊柱旁者9例，胸壁者6例，下肢软组织者6例，椎管内3例，颈部、腋下、肾上腺区各1例。其他儿童小圆细胞肿瘤病例145例，年龄3个月~12岁，平均年龄4.1岁，男女比例为1.27∶1.00。包括分化差型及未分化型NB 40例，RMS 34例（胚胎型23例，腺泡状11例），胚芽为主型WT 30例，淋巴瘤25例（BL 12例，LL 13例），MRT 10例，髓系肉瘤2例，DSRCT 1例，BCOR重排肉瘤1例（图1B），CIC重排肉瘤1例（图1C），MNTI 1例（图1D）。
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讨论小圆细胞肿瘤是儿科病理诊断的重点和难点。随着分子遗传学的发展，基于甲醛固定、石蜡包埋组织的反转录聚合酶链反应和FISH技术已用于该类肿瘤特异性基因的检测，但对于一些穿刺标本或小组织活检，标本量过小使得基因检测受阻，且这类检测费用较高、需要专业的技术人员，多数医院并未开展。基于以上原因，免疫组织化学染色仍是E-EWS及其他小圆细胞肿瘤诊断和鉴别诊断中主要的辅助手段。选择特异而敏感的免疫组织化学标志，做出准确、可信的诊断，才能为后续治疗提供有力指导。FLI1属于ETS（E26 transformation-specific）家族转录因子，最早在Friend病毒诱导的小鼠红白血病细胞中发现，在正常发育和内环境稳定中发挥关键作用［9］，正常表达于内皮细胞和淋巴造血细胞。分子遗传学研究证实，E-EWS存在EWSR1易位与ETS家族成员形成融合基因，约85%形成EWSR1-FLI1融合，并表达FLI1［10］。文献报道，FLI1免疫组织化学染色在E-EWS中的敏感性约为89%［5］，可出现在不同类型融合基因的E-EWS中［2］。FLI1对E-EWS亦有很高的特异性：Folpe等［8］收集了132例成人和儿童小圆细胞肿瘤病例，免疫组织化学染色显示FLI1的特异性为91%，除E-EWS、LL和DSRCT外，包括NB、RMS及WT在内的其他肿瘤中FLI1均为阴性；相似的结果也出现在一项基于组织芯片技术的研究中，3 423例小圆细胞肿瘤，FLI1对E-EWS 的特异性达91.6%［11］。本研究88.9%的E-EWS 表达FLI1，与上述文献报道基本一致。但其特异性仅为5.5%：FLI1在常见的儿童小圆细胞肿瘤中广泛表达，表达程度多数为部分或弥漫阳性，对E-EWS诊断的阳性预测值仅为14.9%。原因可能为：（1）FLI1异常表达通过影响肿瘤细胞的增殖、分化、基因组稳定性等与多种肿瘤的生物学行为有关［12］。不同年龄段的小圆细胞肿瘤患者，如NB［13］、RMS［14］，均存在不同的分子遗传学改变，可能导致FLI1表达不同。本研究病例均为儿童患者，年龄小，分子遗传学情况与国外文献中的病例可能不同，造成结果不一致；（2）部分抗体随着研究样本及肿瘤类型的增多，其特异性下降［15-16］。FLI1敏感性高的报道均为国外较早的数据，近期国内的研究中，FLI1在6/8例RMS，2/2例NB中阳性表达［17］，这与本研究结果相似；（3）抗体克隆号不同，可能导致结果不同［18］。本研究表明，在儿童小圆细胞肿瘤中，FLI1是E-EWS 诊断较为敏感的指标，但在与其他小圆细胞肿瘤的鉴别诊断中价值有限。E-EWS中的嵌合转录因子EWSR1-FLI1驱动下游靶点促进尤文肉瘤的发生、发展［19-21］，NKX2.2是其靶点之一。不论是形态学典型或非典型的E-EWS，不论其伴有EWSR1-FLI1、EWSR1-ERG还是EWSR1-FEV融合基因，NKX2.2均有稳定表达，阳性率为93%~100%［22-23］，被认为是E-EWS诊断的敏感标记。NKX2.2对诊断尤文肉瘤的特异性为85%~88%［7,22］：除 E-EWS 外，NKX2.2主要表达于嗅神经母细胞瘤、间叶软骨肉瘤、小细胞癌和神经内分泌肿瘤，此外个别CIC重排肉瘤、差分化滑膜肉瘤、NB表达NKX2.2。本研究中，NKX2.2对E-EWS具有很高的敏感性（92.6%）和特异性（97.9%）。除E-EWS外，仅个别（2/30例）WT和1例 BCOR重排肉瘤表达NKX2.2，并且阳性程度低，为灶阳或部分阳性。儿童与成人肿瘤发病谱不同，嗅神经母细胞瘤、间叶软骨肉瘤、小细胞癌和神经内分泌肿瘤儿童罕见。因此，NKX2.2在儿童小圆细胞肿瘤中对 E-EWS 的特异性更高。需注意的是，NKX2.2可能易受脱钙剂的影响，在经脱钙处理的标本中，NKX2.2免疫组织化学染色易出现阴性结果［24］。本研究筛选的病例均未经脱钙处理。NKX2.2和FLI1均表达于细胞核，免疫组织化学结果易于识别与判读。之前的文献报道二者对E-EWS均有很高的敏感性和特异性［7,8,22］，但未见仅针对儿童小圆细胞肿瘤的研究。本研究除纳入儿童常见的NB、WT、RMS、淋巴瘤外，还收集了一些好发于儿童的罕见肿瘤，如MRT、DSRCT、髓系肉瘤、尤文样肉瘤（BCOR重排肉瘤和CIC重排肉瘤）及MNTI，是目前国内文献对NKX2.2和FLI1的特异性和敏感性研究的最大样本，对儿童小圆细胞肿瘤病理诊断中免疫组织化学标志的选择具有参考价值。本研究还显示，与NKX2.2单一抗体相比，FLI1和NKX2.2联合检测，并未提高其敏感性及特异性，NKX2.2对于E-EWS的诊断价值更高。综上，在儿童小圆细胞肿瘤中，NKX2.2对E-EWS有很高的敏感性和特异性，可作为一线抗体用于E-EWS的诊断和鉴别诊断；FLI1对E-EWS的诊断具有一定价值，但在其他儿童常见小圆细胞肿瘤中广泛表达，鉴于FLI1与E-EWS融合基因有关，可作为一线抗体用于诊断E-EWS，但在鉴别诊断时应联合其他抗体以及必要的分子检测，以免误诊。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
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