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作者：王梦露 王英燕 王纪文通信作者：王纪文，Email：wangjiwen@scmc.com.cn作者单位：上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心神经内科，上海 200127本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(11):855-860.引用本文：王梦露,王英燕,王纪文.TAT-GluA2CT干扰GluA2/TARPγ-8耦合对癫痫持续状态模型大鼠神经损伤的保护作用[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(11):855-860.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20211110-01336.
摘要
目的 探究应用干扰肽TAT-GluA2CT对氯化锂-匹罗卡品癫痫持续状态模型大鼠海马神经元的保护作用以及最合适的给药时间。方法 应用氯化锂-匹罗卡品建立大鼠癫痫持续状态模型（雄性，72只），同时设立对照组（12只）。采用随机数字表法将大鼠分为癫痫组（12只），对照肽组（12只），干扰肽组（48只），根据给药的时间不同将干扰肽组又分为前1 h组（12只），后2 h组（12只），后4 h组（12只）和后6 h组（12只）。选择对照组、对照肽组、前1 h组、后2 h组、后4 h组、后6 h组各6只，采用Nissl染色、原位末端标记（TUNEL）染色观察海马CA1区神经元形态变化、凋亡发生；选择对照组、对照肽组、前1 h组、后2 h组、后4 h组、后6 h组各6只，采用Western blot和免疫共沉淀实验检测α-氨基-3-羟基-5-甲基异噁唑-4-丙酸(AMPA)受体第二亚单位GluA2表达和GluA2/AMPA受体胯膜调节蛋白家族γ-8（TARPγ-8）复合物耦合的变化情况。采用t检验比较2组间数据差异，用单因素方差分析进行各组间差异的比较。结果 应用干扰肽后，与癫痫组相比，各干扰肽组神经元数量明显增加，差异有统计学意义（癫痫组20.07±3.51，前1 h组39.40±2.39，后2 h组38.43±2.42，后4 h组30.30±2.55，后6 h组27.93±3.20，F=235.28，P<0.05）；各干扰肽组与癫痫组相比，凋亡细胞数量明显减少，差异有统计学意义（癫痫组31.47±3.19，前1 h组7.30±3.45，后2 h组9.27±3.81，后4 h组12.86±3.08，后6 h组14.43±3.13，F=248.60，P<0.05）；与对照组相比，诱导癫痫后海马GluA2表达量减少，差异有统计学意义（对照组21 626.53±2 700.58，癫痫组14 578.16±2 917.02，前1 h组13 375.47±3 180.54，后2 h组15 244.10±1 390.41，后4 h组15 799.16±4 559.49，后6 h组15 722.95±1 756.01，F=3.83，P<0.05），各干扰肽组与癫痫组之间GluA2表达量差异无统计学意义（F=0.45，P=0.77）；与癫痫组相比，各干扰肽组GluA2/TARPγ-8耦合减少，差异有统计学意义（癫痫组24 509.80±3 718.54，前1 h组12 055.18±5 847.11，后2 h组9 630.51±5 805.17，后4 h组12 749.35±7 108.45，后6 h组11 092.98±7 330.08，F=10.68，P<0.05）；与癫痫组相比，前1 h组大鼠发作潜伏期延长、发作评级降低，差异有统计学意义［癫痫组潜伏期(18.58±3.99) min，前1 h组(103.25±9.21) min，t=29.23，P<0.05］。结论 干扰肽TAT-GluA2CT可减轻癫痫大鼠海马区神经元损伤，在匹罗卡品前1 h或后2 h应用干扰肽对于神经元的保护作用最为明显。
关键词
癫痫持续状态；α-氨基-3-羟基-5-甲基异噁唑-4-丙酸受体；AMPA受体跨膜调节蛋白家族；GluA2/ TARPγ-8 复合物
兴奋和抑制神经递质失调是导致癫痫发生最重要的机制之一［1-2］，谷氨酸（Glu）作为哺乳动物中枢神经系统最主要的兴奋性神经递质，其离子型受体α-氨基-3-羟基-5-甲基异噁唑-4-丙酸（AMPA）介导的兴奋性神经毒性与癫痫导致的海马区神经损伤密切相关。AMPA受体跨膜调节蛋白家族γ-8（TARPγ-8）作为在海马区高度表达的亚型，能够与AMPA受体结合并对其进行调节，TARPγ-8依赖性AMPA受体拮抗剂在多种动物模型中都展现了良好的抗癫痫活性，并能避免传统抗癫痫药物所带来的不良反应［3-6］，但其对AMPA受体的不同亚基并不具备选择性。本课题组发现,癫痫大鼠海马区GluA2/TARPγ-8耦合程度明显增加，推测二者耦合参与AMPA受体介导的神经兴奋性毒性，打断二者相互作用能够减轻癫痫大鼠海马区神经元损伤，本课题组根据GST-pulldown实验［7］确定了二者的结合区域并据此合成了相应的干扰肽（TAT-GluA2CT）。本研究旨在探索干扰肽TAT-GluA2CT在氯化锂-匹罗卡品大鼠癫痫持续状态模型中是否能产生神经保护作用以及最合适的给药时间。
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材料与方法1.1 实验动物与分组 健康8周龄，体质量250~300 g的SD雄性大鼠84只［由上海吉辉实验动物饲养有限公司提供，实验动物合格证号SCXK（沪）2017-0012］，予适宜温度和湿度饲养环境，自由进食和饮水。按照随机数字表法，将其分为干扰肽组、对照肽组、癫痫组、对照组，其中干扰肽组又按照予干扰肽的时间不同分为前1 h组、后2 h组、后4 h组和后6 h组。取癫痫组、对照组、对照肽组、前1 h组、后2 h组、后4 h组、后6 h组大鼠各6只制作石蜡切片，进行尼氏染色、原位末端标记染色（TUNEL）；选取癫痫组、对照组、对照肽组、前1 h组、后2 h组、后4 h、后6 h组大鼠各6只，取海马组织进行Western blot实验及免疫共沉淀实验。1.2 方法1.2.1 大鼠癫痫持续状态(SE)模型的建立 氯化锂-匹罗卡品癫痫模型诱导出SE，可引起多个脑区神经元严重病变，其中以海马区损伤最严重［8-10］，该模型可有效模拟人类颞叶癫痫的发生发展过程，并与人类癫痫具有相似的病理表现。大鼠腹腔注射氯化锂127 mg/kg，18~24 h后腹腔注射匹罗卡品（APE x BIO公司，美国）30 mg/kg，予匹罗卡品前0.5 h腹腔注射阿托品1 mg/kg，15~30 min开始出现SE,待SE出现约1 h后予地西泮10 mg/kg以缓解抽搐。根据Racine分级标准对大鼠进行分级，出现4级及4级以上发作视为诱导成功，纳入癫痫组［11］。1.2.2 干扰肽TAT-GluA2CT制备 干扰肽和对照肽由浙江昂拓莱司生物技术有限公司合成。干扰肽TAT-GluA2CT蛋白序列为：YGRKKRRQRRR-R AEAKRMKVAK NPQNINPSSS QNSQNFATYK EGYNVYGIES VKI；对照肽蛋白序列为：YGRKKRRQRRR-I KVSEIRYVGN YERKYTAFNQ SNQSSSPNIN QPNKMKGAEA KAV。1.2.3 海马立体定位注射给予干扰肽TAT-GluA2CT根据分组不同，在给予匹罗卡品前1 h、后2 h、后4 h、后6 h通过海马立体定位技术按照50 nmol/kg 注射干扰肽TAT-GluA2CT，后续按照正常步骤建立大鼠SE模型。对照肽组：海马立体定位给予等量对照肽，后续按照正常步骤建立大鼠SE模型。癫痫组：按正常步骤诱导癫痫持续状态；对照组：予127 mg/kg氯化锂后18~24 h腹腔注射等剂量9 g/L盐水。1.2.4 心脏灌流取材 对照组和其余各组诱导SE发作后72 h处死大鼠，每组选择6只大鼠用冷9 g/L盐水心脏灌流后冰上快速取脑组织，多聚甲醛固定后脱水、透明、石蜡包埋、切片，切片厚度为5 μm，后续用于尼氏染色及TUNEL染色等。1.2.5 尼氏染色 石蜡切片常规脱蜡至水，尼氏染色液染色3~10 min，蒸馏水洗涤2次，950 mL/L乙醇分化至背景无色，直接观察或进行脱水、透明、封片等处理。在400倍显微镜下计数CA1区神经元数量。1.2.6 TUNEL染色 石蜡切片常规脱蜡至水，滴加不含DNase的蛋白酶K，室温作用15~30 min，在过氧化物酶强力封闭液中孵育20 min，滴加生物素标记液，室温避光孵育60 min，滴加Streptavidin-HRP工作液，室温孵育30 min，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后滴加DAB显色液，室温孵育5~30 min，PBS洗涤后苏木素复染细胞核。直接进行观察或者常规脱水、透明后中性树脂封片观察。每组选择凋亡细胞最明显的3个×400高倍视野，计算每个高倍视野下的凋亡细胞，取平均值。1.2.7 Western blot法检测GluA2表达 剥离海马组织，提取总蛋白并测定蛋白浓度。配制凝胶，每孔上样约20 μg，电泳转膜后置封闭液中室温摇床孵育60 min，TBST清洗3次，加入兔GluA2抗体（1∶1 000，美国Cell Signaling Technology公司），小鼠GAPDH抗体（1∶10 000，美国Abcam）4 ℃过夜，辣根过氧化物酶偶联第二抗体室温摇床孵育60 min。使用Tanon蛋白成像仪进行显影，测出各条带灰度值。以GAPDH为内参调节上样误差，以目的蛋白/内参蛋白灰度值作为蛋白相对表达量。1.2.8 免疫共沉淀法测定GluA2/TARPγ-8耦合 冰上快速剥离海马组织，取适量组织匀浆器匀浆，加入RIPA及IP细胞裂解液与PMSF 100∶1混合液裂解蛋白30 min。取200 μg蛋白样品，用PBS稀释至1 μg/μL，加入1 μg 兔IgG和20 μL充分重悬的Protein A+G Agarose，4 ℃缓慢摇动30 min~2 h，2 500 r/min（离心半径8.5 cm）离心5 min，取上清液；加入0.2~2.0 μg用于免疫沉淀的一抗，4 ℃缓慢摇动过夜，加入40 μL充分重悬的Protein A+G Agarose，4 ℃摇动1~3 h，2 500 r/min（离心半径8.5 cm）离心5 min，弃上清，用PBS洗涤沉淀5次，每次PBS用量为0.5 mL，洗涤后离心弃上清，离心条件同前；加入40 μL 1×聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液，瞬时高速离心把样品离心至管底，100 ℃煮蛋白5 min，后续步骤同Western blot实验，将各组TARPγ-8与GluA2灰度值之比进行比较，得出TARPγ-8/GluA2的耦合变化。1.3 统计学处理 应用SPSS 22.0软件对结果进行统计分析。正态分布计量资料采用x̄±s表示，2组间比较采用t检验，各组间差异的比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
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结果2.1 匹罗卡品诱导癫痫的潜伏期及成功率 对比癫痫组与前1 h组间诱导成功率和潜伏期（从给予匹罗卡品到出现 Ⅳ 级及Ⅳ级以上发作为潜伏期）。相比于癫痫组，应用干扰肽后，前1 h组大鼠达到 Ⅴ 级发作的比例减少，发作程度明显减轻（癫痫组 Ⅳ 发作成功率16.67%，Ⅴ 级发作成功率83.33%；前1 h组 Ⅳ 发作成功率41.67%，Ⅴ 级发作成功率58.33%），潜伏期明显延长［癫痫组 (18.58±3.99) min；前1 h组 (103.25±9.21) min，t=29.23，P<0.05］。2.2 不同时间点给予干扰肽TAT-GluA2CT后海马区形态变化 尼氏染色，对照组大鼠海马CA1区神经元排列整齐，形态正常，结构清晰，胞质内可清楚地观察到排列紧密的尼氏小体，无神经元丢失。癫痫组大鼠海马CA1区神经元排列紊乱、染色不均、神经元数量减少，结构模糊不清。干扰肽组大鼠海马CA1区神经元排列较整齐，结构形态相对正常，尼氏小体数量较癫痫组明显增加（癫痫组20.07±3.51，前1 h组39.40±2.39，后2 h组38.43±2.42，后4 h组30.30±2.55，后6 h组27.93±3.20，F=235.28，P<0.05），其中前1 h组与后2 h组神经元丢失情况相对最少，组间差异无统计学意义（t=1.56，P=0.12）；前1 h组和后2 h 组分别与后4 h组和后6 h组比较差异有统计学意义（与前1 h组相比，F=146.85，P<0.05；与后2 h组相比，F=120.77，P<0.05）。结果见图1。
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讨论AMPA受体作为配体门控离子通道，对于突触传递和可塑性至关重要［12］，不同的亚基组成导致AMPA受体对离子的通透性不相同。神经退行性变的GluA2假说认为在正常表达钙不通透通道的神经元中，Ca2+通过缺乏GluA2的AMPA受体进入有助于或导致内源性Glu反应的延迟性细胞死亡［13-15］。神经元发育早期阶段由于GluA2表达较低，可能导致未成熟的大脑癫痫敏感性增加［16］，但伴随着神经元的逐步成熟，GluA2表达逐步增加，成熟阶段的神经元中AMPA受体大多以GluA1/GluA2异构体的形式存在［12,17］，并且由于Q/R编辑后的GluA2对Ca2+不具有通透性［18-20］，即使癫痫发生后Glu释放增加引起AMPA受体过度激活，也难以造成Ca2+内流超载引起神经细胞损伤。因此，AMPA受体过度激活是通过何种机制最终引起神经元兴奋性毒性仍未明了。研究表明，诱导SE后海马CA1区GluA2表达量降低而不含GluA2的AMPA受体表达明显增多［21-22］，神经细胞对Ca2+的通透性增加，Ca2+内流增加最终导致神经细胞变性凋亡，不同时间点GluA2的表达量并不相同，以SE后72 h降低幅度最为明显，且此时神经细胞损伤与丢失情况也最为明显，二者变化相对一致，表明GluA2可能在其中发挥了作用［23-24］。本研究也证实SE后72 h（即癫痫组）GluA2表达量较对照组大幅度降低，但应用干扰肽后，GluA2的表达量与癫痫组相比差异无统计学意义，与GluA2表达情况相反的是神经元凋亡和丢失情况均明显减轻。有研究表明，SE后突触膜表面的GluA2表达减少，而在胞内的积聚增多［21,25］。因此推测，癫痫后海马GluA2膜表达减少,对Ca2+的通透性增加，可能导致细胞内Ca2+超载和神经元损伤。AMPA受体受多种辅助蛋白调控，TARPs是其中之一。不同亚型的TARPs在中枢神经系统的表达并不相同，TARPγ-8在海马区高度表达。以往研究证明，TARPγ-8过表达或敲除并不影响编码GluA2的mRNA的含量，而是影响GluA2在膜表面的表达［26］，说明TARPγ-8可能介导细胞内不含GluA2的AMPA受体向膜表面转运以及影响AMPA受体的稳定性。近年来，高通量药物化学筛选已经确定了多种能选择性靶向与TARPγ-8相关的AMPA受体的化合物（如CERC-611），并有望用于癫痫治疗。本研究结果显示，与对照组相比，SE后72 h GluA2与TARPγ-8耦合明显增加，总GluA2表达减少，神经细胞损伤与凋亡明显；与癫痫组相比，应用干扰肽后，GluA2与TARPγ-8耦合减少，总GluA2表达无明显变化，神经细胞损伤情况有明显改善；在注射匹罗卡品前1 h 和后2 h给予干扰肽对神经细胞的保护作用最为明显。应用干扰肽后，相比于海马神经元损伤的明显改善与GluA2/TARPγ-8的耦合减少，海马区GluA2蛋白的表达量无明显变化，在一定程度上证实TARPγ-8对于AMPA受体的调控可能与GluA2的内化有关，而与其表达量无关。GluA2/TARPγ-8在癫痫发生后耦合增加的情况，国内外尚未有报道，本研究结果无法认定二者耦合是导致癫痫发生的关键机制，但提供了一个研究癫痫发病机制的新视角。以后将进一步确定应用干扰肽后海马区神经元编码GluA2的mRNA表达情况，以及GluA2在膜表面的分布情况。
参考文献略（制作：新乡医学院期刊社网络与数字出版部）
《中华实用儿科临床杂志》
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