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肺癌作为所有癌症死亡的主要原因，与吸烟有密切关系。香烟烟雾中的化学致癌物，如多环芳烃（PAHs），会引发DNA损伤，导致致癌突变。尽管吸烟者患肺癌的风险取决于吸烟量，但目前尚不清楚这种增加的风险是否反映了正常肺细胞中体细胞突变累积速率的增加。
2022年4月，上海交大研究团队在NatureGenetics 上发表题为“Single-cell analysis of somatic mutations in human bronchial epithelial cells in relation to aging and smoking” 的论文，该研究发现，在未吸烟者中，随着年龄的增长，单核苷酸变异以及小片段插入和缺失的频率增加，且吸烟者的突变频率显著升高。当以吸烟包年为横坐标绘制图表时，突变随癌症风险的线性增加而增加，直到约23包年后，突变频率不再进一步增加，这表明了个体对避免突变的选择。已知的肺癌特异性突变特征随年龄和吸烟量而变化。未观察到肺癌驱动基因中体细胞突变的显著富集。
肺癌作为所有癌症死亡的主要原因，与吸烟有密切关系。香烟烟雾中的化学致癌物，如多环芳烃（PAHs），会引发DNA损伤，导致致癌突变。流行病学研究根据终生吸烟总量、持续时间、强度和戒烟时间估计了患肺癌的风险。据报道，70%的与吸烟相关的死亡发生在老年人群中，而80-90%的终生吸烟者从未患过肺癌。从人口队列研究中解释这些观察结果对于理解其分子和遗传机制至关重要，但全面分子风险评估的缺乏，包括早期致癌的分子评估，在很大程度上限制了这种理解。
尽管来自吸烟者肺癌的肿瘤细胞通常包含从干/祖细胞继承并在肿瘤进展过程中积累的数万个体细胞突变，但关于正常人类近端支气管基底细胞（PBBCs，基于气道地形和细胞标记物的鳞状细胞癌的主要候选祖细胞中的体细胞突变情况却鲜有研究。此类研究的主要挑战在于体细胞突变的随机性和稀疏性，即不同细胞间的体细胞突变各不相同。为了识别体细胞突变并准确估计其在正常组织中的频率，必须进行单细胞全基因组测序（WGS），因为每个细胞在其生命周期中都会获得独特的体细胞突变集。在最近的一项研究中，研究人员通过将单个细胞培养成克隆，然后对这些克隆进行WGS并使用常规测序和变异调用方法识别突变，从而量化了正常支气管上皮中的突变负担。对16名个体的分析揭示了吸烟和衰老对突变频率的复合影响。然而，为了定量评估衰老和吸烟量对突变负担的影响，需要对由不同年龄段的从不吸烟者和吸烟量差异较大的吸烟者组成的大型队列进行系统分析。
研究者们对33名年龄在11至86岁之间、吸烟史从从未吸烟到116包年不等的参与者的近端支气管基底细胞进行了单细胞全基因组测序。为了描述突变谱，研究人员在支气管镜检查过程中从总共31名参与者中获得了PBBCs，这些检查通常用于肺结节评估（如癌症的可能性）、机会性/罕见感染担忧、结构异常探索或其他临床指征。参与者包括12名无吸烟史的成年人（从未吸烟者）和19名吸烟者，其中包括7名前吸烟者和12名当前吸烟者。为了扩大队列以研究年龄的影响，研究人员从两家商业机构获得了另外两名青少年捐赠者的PBBC样本（Lonza）。在19名吸烟者中，有14人被诊断为肺癌，而只有1名从未吸烟者患有肺癌。通过光纤支气管镜刷取主叶支气管的气道上皮样本，在培养中短期传代3-4周以选择生长PBBCs，然后在-80°C下快速冷冻。对来自肺癌患者和无癌参与者的14个未培养样本进行了细胞形态学评估，以确保初始样本中没有明显的恶性细胞。对于每位参与者，从冷冻的PBBC沉淀物中分离出细胞核，并如先前对单个细胞的研究所述，确定三个到八个单个细胞核的突变频率和突变谱18,20。在所有测序的细胞核中，以≥20×的深度检测了基因组的26.6%±9.3%，单核苷酸变异（SNVs）的灵敏度为0.68±0.12，小插入和缺失（INDELs）的灵敏度为0.40±0.07。
【在从不吸烟者中，随年龄增长肺基底细胞癌（PBBCs）的突变累积情况】
为了研究PBBCs中突变频率与年龄的关系，研究者对从未吸烟者的单个PBBC细胞核中的体细胞突变（包括SNVs和INDELs）进行了定量分析，并根据基因组覆盖率和灵敏度进行了校正。参与者的每个细胞核中的SNV中位数数量在464±108（11岁）至2,739±778（86岁）之间变化，这大致对应于每年每细胞28个突变的速率（P=3.9×10−3，广义线性混合效应模型（GLME）。尽管缺乏统计学显著性，但参与者每个细胞核中的INDEL中位数数量也随年龄增长而增加，从59±18（11岁）到304±94（86岁），这对应于每年每细胞约两个INDEL（P=0.28，GLME）。值得注意的是，来自最年轻捐赠者的PBBCs中每个细胞核的SNV中位数数量与之前报道的年轻参与者B淋巴细胞20或肝细胞18中的数量在同一范围内。然而，随着年龄增长，PBBCs中的突变积累速率约为肝细胞的一半，与在人类B淋巴细胞中观察到的速率大致相似。
尽管体细胞突变通常是随机的，但它们可以根据宿主细胞的选择性优势进行扩增，这一过程在癌症中得到了充分记录，但也适用于其他疾病，如慢性阻塞性肺病。因此，研究人员分析了数据集中已知肺癌和全癌驱动基因25的体细胞突变情况。在来自吸烟者和非吸烟者细胞核中观察到的所有100,656个体细胞突变中（包括六个异常细胞核），有21个突变位于肺癌驱动基因中，出现在11%的细胞核中；有111个突变位于全癌驱动基因中，出现在50%的所有细胞核中。然而，使用随机基因集的置换测试表明，肺癌（P=0.73）或全癌（P=0.81）驱动基因中的突变在统计学上并没有显著富集。因此，尽管如上所述，在六个异常细胞中，癌症驱动基因中的共享突变表明了对生长优势的克隆选择，但在来自吸烟者或非吸烟者的其他任何细胞核中均未观察到此类选择的证据。
接下来，研究团队分析了数据集中与衰老或吸烟相关的体细胞突变特征。对吸烟者PBBCs中发现的单碱基替换（SBS）特征的分析显示，存在SBS4特征，而在从未吸烟者中则几乎不存在。SBS4已被证实为吸烟者肺肿瘤中的主要特征。尽管归因于SBS4的突变数量在吸烟者中显著更高（通过线性混合效应（LME）模型P=6.7×10−19），但它与年龄无相关性（P=0.40，LME）。归因于SBS5的突变被发现与吸烟状态显著相关（P=2.2×10−2，LME），但与时间年龄的相关性更强（P=4.1×10−6，LME）从所有参与者（包括吸烟者和从未吸烟者）中提取的其他14个特征，与各种分子机制相关。
【突变特征和吸烟（习惯）】
INDELs的特征与从吸烟者肺癌或正常肺细胞中提取的特征相匹配，也与体外暴露于多环芳烃（PAHs）的细胞产生的特征相匹配。吸烟者的INDELs特别富含ID3，这是一种与肺癌组织中吸烟相关的单碱基胞嘧啶（鸟嘌呤）缺失的INDEL特征。这些发现表明，正常组织中与衰老和吸烟相关的突变的分子机制与肿瘤中的相似。
癌症风险随年龄增长呈指数级增加，这很可能是体细胞中突变积累的结果，这些突变随后会经历多轮选择和进一步突变。由于香烟烟雾中已知的诱变化合物，吸烟者患肺癌和其他各种癌症的风险增加，这一逻辑随后出现。尽管与大多数其他肿瘤相比，肺癌中的突变频率更高，这很可能反映了产生肿瘤的肺细胞的突变负担，但从未证明过吸烟者和非吸烟者正常人肺中随年龄增长而增加的突变。这是由于测量正常细胞中体细胞突变的难度很大，这需要单细胞方法。在该论文中，介绍了人体肺细胞体细胞突变随年龄和吸烟状况变化的单细胞分析。
对广泛年龄段内吸烟者和非吸烟者人类肺部的单细胞体细胞突变分析证实了吸烟通过增加体细胞突变频率来增加肺癌风险的模型，这是之前的假设但从未通过实验证实。重要的是，该研究结果解释了为什么大多数吸烟者从未患过肺癌。事实上，研究团队观察到重度吸烟者中突变频率趋于稳定，这强烈表明存在内在因素通过减少突变来降低肺癌风险，例如通过提高DNA修复的准确性或优化烟草烟雾的解毒作用来减少DNA损伤。这项研究为进一步评估这些调节正常支气管细胞突变敏感性的内在肺癌风险因素的性质提供了合理依据。
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