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败血症的治疗评估和患者预后主要取决于及时给予适当的抗生素。然而，用于分层和选择患者特异性最佳治疗的临床方案极为缓慢。在这过程中，快速抗菌药物敏感性测试（AST）的主要障碍在于耗时较长的血培养过程，由于患者血液中病原体数量有限，这一过程长期以来一直被认为是不可避免的。
2024年7月24日，韩国首尔国立大学在Nature上发表了题为 “Blood culture-free ultra-rapid antimicrobial susceptibility testing“ 的研究论文，该研究旨在对一种基于表型的超快速AST（uRAST）平台进行测试，该平台能够直接从患者的全血中进行药物敏感性分析，无需血培养。该研究通过招募190名疑似感染的住院患者进行了临床评估，菌种鉴定准确率达100%。在8例阳性病例中，对6例临床分离株进行了回顾性AST测试，结果显示与理论上的平均周转时间（从初始血液处理开始计算为13±2.53小时）相比，总体分类一致率为94.90%。
微生物病原体入侵引起的感染可触发宿主失控的免疫反应。如果感染得不到及时识别和治疗，病情会进一步发展为脓毒症或脓毒性休克，这是导致死亡的主要原因之一。每年，全球有超过4000万人受到脓毒症的影响，死亡率高达20-50%，仅在美国就造成了约250亿美元的社会经济负担。尽管该病往往可治，但患者预后在很大程度上取决于治疗的时机。研究表明，延迟给予适当的抗生素治疗会显著影响患者生存率，尤其是脓毒性休克患者。因此，在初步治疗中，迅速启动靶向抗菌治疗已被认为是关键干预措施。
然而，目前用于通过AST为菌血症患者选择特定于患者的最佳治疗方案的协议极为耗时。AST包括一系列复杂的诊断程序，以告知感染的存在、确定致病微生物种类并评估对各种药物及其浓度的敏感性谱。整个过程通常需要至少2-3天的周转时间（TAT），这必然要求临床医生启动经验性广谱抗生素治疗，但同时又迫使他们这样做4。这意味着在初始治疗阶段开具的处方往往不够充分，这可能会危及患者生存，直到获得有效的AST结果。据估计，在开具给人类患者的抗菌药物中，有14-78%是不必要的或无效的。最近的研究表明，通过缩短TAT，可以潜在地降低患者死亡风险、缩短住院时间和降低医疗费用。因此，开发新策略以大幅缩短AST的总TAT至关重要。
最近，已经展示了几种“快速”表型AST技术，这些技术通过结合如血细胞裂解、离心或过滤等策略，直接从阳性血培养瓶中进行AST，从而避免了纯培养的需要。然而，由于入侵病原体的固有生长特性（倍增时间），冗长的血培养期仍然是必不可少的，且不太可能得到改善。尽管已经引入了几种基因型AST和ID检测，用于直接应用于全血样本，但这些基于分子的方法通常由于细胞计数有限、周围血液成分和下游反应中的损失而导致灵敏度较低。此外，已观察到遗传耐药性并不总是与表型敏感性相关，更重要的是，由于测量最低抑菌浓度（MIC）存在挑战，这些检测仅限于促进药物回避，而无法指导临床医生选择最佳治疗药物。
为此，研究人员提出了一种基于表型的超快速AST（uRAST）平台，该平台能够直接从患者的全血中进行药物敏感性分析，无需血培养。此外，研究人员还介绍了一种高灵敏度、无需血培养、可在工作流程中同时提供病原体种类信息的病原体鉴定检测，这对于准确的AST解释至关重要。与商业化的医院AST方法相比，该方法理论上可将TAT缩短40-60小时以上，从而实现快速TAT的抗生素处方。最后，研究团队设计了一项临床研究，并将其技术应用于总共190名住院的疑似感染患者，以进行验证。
从初始治疗开始，患者每6-8小时定期接受广谱抗生素治疗。虽然无法避免一线治疗，但理想情况下，应在开具第二剂抗生素处方时尽早获得AST结果。然而，根据所涉及的微生物种类，血培养可能需要24小时或更长时间，这已经超过了这一关键时间点。为了缩短这一生长期，必须加速病原体增殖，并尽量减少AST分析所需的接种物数量。uRAST旨在实现这两个目标，首先通过从全血中分离出被宿主细胞、抗生素和生长抑制剂包围的微生物，然后进行菌种鉴定，在纯培养基中加速培养，并实施一种基于表型成像的AST芯片，该芯片在细胞数量比标准化协议低几个数量级的情况下进行敏感性测试，所有这些都有助于显著缩短总周转时间（TAT）。
【uRAST的设计及工作流程】
由于入侵的病原体通常是未知的，因此必须进行富集，以覆盖广泛的菌株，并确保微生物在后续分析中保持活性和完整性。为实现这一目标，研究人员使用了装饰有合成β2-糖蛋白I（sβ2GPI）肽的磁性纳米颗粒，这些纳米颗粒之前已被研究人员用于病毒分离。β2GPI是一种急性期血浆蛋白，已知参与人体先天免疫反应，能够自然识别病原体相关分子模式的共同基序。为了表征病原体富集性能，研究人员将五种最常观察到的感染菌株细胞系以不同的细菌浓度接种到5毫升的磷酸盐缓冲液（PBS）或血液中。整个程序在纳米颗粒注射、病原体结合、磁分离和重悬于1毫升PBS或新鲜阳离子调节的Mueller-Hinton肉汤（MHB）培养基中后1小时内完成。通过优化后的方案，在细菌浓度为1000 CFU/ml时，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的捕获效率分别达到了96.23±3.31%和91.54±4.35%。为了匹配生理范围内的相关比例，研究人员再次使用较低的细菌载量（1-10 CFU/ml）测试了E. coli、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌（均为革兰氏阴性菌）以及S. aureus和粪肠球菌（均为革兰氏阳性菌）的效率。尽管捕获量略有减少，但所有菌株均成功捕获。此外，白细胞（WBC）和红细胞（RBC）的耗竭率分别高于99.90%和99.99%。
【使用sβ2GPI肽包被纳米颗粒进行细菌分离的特性研究】
在药敏试验（AST）中，为了确定每种药物-病原体组合的敏感性断点，必须明确入侵病原体的种类。为了确认并区分病原体类型，研究人员开发了使用形状编码微盘的快速图谱鉴定试验（QmapID）。该试验包括一个硅胶涂层微盘库（直径50µm），每个微盘的羧化表面上都固定有单链DNA探针（5'-氨基修饰），这些探针可以与相应病原体的基因组序列杂交。每个基因都被分配了独特的孔图案，并编码用于一锅式多重分析（超过100重），并嵌入磁性纳米颗粒以便于微盘操作。对于单次反应，将带有不同DNA探针集的27种不同微盘粒子类型各100个混合使用。从富集后的1毫升重悬溶液中，裂解细菌细胞以提取基因组DNA（gDNA），然后使用两步嵌套PCR和生物素标记进行扩增。随后，扩增产物与特异性微盘杂交，并使用荧光染料进行成像检测。通过解码孔图案并分析荧光强度分布和平均值，在3小时内验证了细菌特异性基因的存在。
【QmapID测定法在病原体识别中的特性研究】
为了评估该试验，研究人员从36种临床分离株中预先提取了基因组DNA（gDNA），并将其以每反应100 fg的浓度溶解在磷酸盐缓冲液（PBS）中。根据从单个细菌细胞中提取并测量的基因组内容的平均重量（约8-10 fg），该量大致相当于10个菌落形成单位（CFU）的病原体。总体而言，除了阴沟肠杆菌外，所有临床菌株的细菌鉴定均成功区分，且未出现明显的交叉反应。此外，这种多重功能使研究者能够仅通过扩展基因组范围（超出物种鉴定范围）就使用QmapID同时分析耐药基因。接下来，结合使用sβ2GPI纳米颗粒进行细菌富集，研究人员重新检查了QmapID试验在血液中的检测限。同时使用了多种血液制备程序，包括简单稀释、红细胞裂解和离心，以评估每种方法的耗竭效果。与其余方法相比，这些方法需要超过5×10³ CFU/ml的大肠杆菌才能可靠检测，而该方法检测限低于5 CFU/ml，导致基因检测灵敏度提高了1000倍。最后，在5毫升血液中以3-5 CFU/ml的接种量重复测试了六种不同物种的临床分离株。
与QmapID并行，富集过程后收集的纯化血液病原体也被用于药敏试验（AST）。为此，研究者在1毫升新鲜培养基中增殖这些细胞，以加速其生长（“快速培养法”）。为了验证这一假设，研究人员在全血中加入3-5 CFU/ml的大肠杆菌或金黄色葡萄球菌，然后使用β2GPI纳米颗粒进行富集并快速培养，或者为了比较，将其注入含有可吸收抗生素或微生物生长抑制剂的商用血培养（BC）瓶中。在4-10小时的孵育后，对两种情况的细菌浓度进行定量。正如预期，与标准的BC操作相比，在纯培养基中有效去除血液成分后，病原体的生长得到了极大增强，对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，在10小时培养后浓度分别增加了9.76倍和19.01倍。
为了获得各种抗生素反应的全面概况，每种样品使用两个药敏试验芯片，分别同时评估革兰氏阴性和革兰氏阳性菌种的179和160种药物-剂量组合。研究人员将每孔的目标接种量设定为500 CFU，即药敏试验的总输入量为5×10⁴个细胞。考虑到细菌的双倍时间为30-40分钟，这相当于大约6小时的快速培养。通过减少接种量，由于培养过程中相邻细菌细胞引起的局部压力下降，菌落区域在基质内迅速扩展，这有助于观察和确定生长情况。最后，研究人员使用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌评估了各种抗生素的最低抑菌浓度（MIC），以研究药敏试验的准确性。与微量肉汤稀释法（BMD）结果相比，除青霉素外，所有药物的MIC差异均在一个稀释度以内，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的总体基本一致性分别为100%（20/20）和93.3%（14/15）。
【基于96孔板的低投入抗菌药物敏感性试验（AST）芯片的设计与特性研究】
该研究共纳入了190名患有血液系统恶性肿瘤并疑似感染的住院患者。对于每位患者，当观察到体温异常升高（发热）时，从四个到五个不同部位（包括多条导管线路和周围体）采集5-10毫升全血样本。所有样本均根据医院建立的协议进行分析，包括血培养（BC）、革兰氏染色/化学试验（过氧化氢酶、凝固酶和三糖铁琼脂试验）、纯培养、使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）进行菌种鉴定（ID）以及使用VITEK2（bioMérieux，革兰氏阴性菌）或Phoenix M50（Becton Dickinson，革兰氏阳性菌）进行药敏试验。此外，还从纯培养物中进行了常规微量肉汤稀释法（BMD）试验，以作为真实参考标准。在初次采血时，同时从红色管腔希克曼导管（H.Red）中采集5-10毫升样本至EDTA管中，并使用QmapID进行测试。在排除因医院污染、运输延误等原因不符合招募标准的16个样本后，基于血培养结果，174名患者中有16名（9.20%）检测出血液感染。仅考虑来自H.Red测试的样本，16例感染病例中有8例呈阳性。这与盲测QmapID的结果完全一致，更重要的是，QmapID测定获得的菌种鉴定信息与MALDI-TOF的鉴定信息达到了100%的一致性。
研究团队选择性地对QmapID鉴定为感染阳性的血液样本进行了uRAST的回顾性验证。为了模拟患者血液样本，研究人员从医院后续获得了六株患者来源的屎肠球菌（n=2）、大肠杆菌（n=1）和肺炎克雷伯菌（n=3），并将它们分别加入全血中（5 CFU/ml）进行处理。将其结果与微量肉汤稀释法（BMD）进行比对，研究人员确认了总体分类一致性为94.90%（93/98），其中轻微误差率为5.10%（5/98），基本一致性为94.44%（34/36）。这一表现符合美国食品药品监督管理局（FDA）对药敏试验（AST）平台的要求（分类一致性≥90%，轻微误差≤10%，重大误差≤3.0%，非常严重误差≤1.5%）。有趣的是，uRAST的分类一致性略高于VITEK2或Phoenix M50的结果。最重要的是，与医院药敏试验相比，应用uRAST显著缩短了周转时间（TAT），平均缩短了47.99±9.69小时（P<0.0001）。假设uRAST所有程序均实现全自动化，并排除实验室有限药敏试验工作时间（非技术性）导致的延误，差异更为显著，达到了62.99±15.44小时（P=0.0002）。最后，与医院革兰氏染色/化学试验相比，QmapID缩短了13.11±6.16小时的周转时间（P=0.0034）。
【应用QmapID与uRAST对疑似感染患者的临床研究】
综上所述，该检测方法有可能绕过血培养（BC）的需求，从而实现广泛物种的病原体鉴定，并在患者抽血当天提供表型药物敏感性结果。该平台有潜力指导临床医生及时给予最佳治疗，从而挽救许多生命，同时也有助于减缓抗菌素耐药性的传播，并延长现有抗生素的使用寿命。
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